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摘要 目的 :评价二氢杨梅素(DMY) 对小鼠黑色素瘤细胞 B1 6 的影响 , 并揭示其抑制黑色素产生的 作用机制 。 方法 :CCK8 法筛选 DMY 对 B1 6 细胞增殖活性影响的最佳浓度 。 分为对照组 、模型组(α- MSH) 阳性药组(α-MSH +熊果苷) 、给药组(α-MSH + DMY) , 采用 CCK8 法测定不同组别 B1 6 细胞 的增殖活性 ,ELISA 法检测 B1 6 细胞中黑色素和酪氨酸酶的含量 , 透射电镜观察细胞中黑素小体数 量 ,分子对接法预测 DMY 降低黑色素含量作用的蛋白 , 免疫荧光 法 和 Western blot 分 别 测 α-MSH 和 MITF 蛋白的表达 。 结果 :DMY 抑制 B1 6 细胞增殖的最佳浓度为 6 2 . 5 μmol · L- 1 。 最佳浓度下 , 与模型组相比 ,DMY 可以抑制 B1 6 细胞的增殖 , 降低黑色素和酪氨酸酶含量 , 减少黑素小体数目 , 抑 制 α-MSH 和 MITF 蛋白表达 。 结论 :二氢杨梅素通过调节 α-MSH/MITF 通路抑制 B1 6 细胞产生黑 色素 。
关键词 二氢杨梅素,B16细胞,黑色素,α-MSH/MITF通路
Dihydromyricetin through α-MSH/MITF pathway inhibits melanin production
Wan Min1 , Chen Ying2 , Li Jing3 , Tong Sui-j u1 , Wang Kun-ling1 , Dong Su4 , Fu Wei4 (1 . Pharmacy Department of Dong xihu District People's Hospital , Wuhan 4 3 0 0 0 0 ,China; 2 . Department of Pediatrics, Dong xihu District People's Hospital , Wuhan 4 3 0 0 0 0 ,China;3 . School of Pharmacy , Central South University for Nationalities, Wuhan 4 3 0 0 7 4 ,China; 4 . Pharmacy Department of Dong xihu District People's Hospital , Wuhan 4 3 0 0 0 0 ,China)
Abstract : Obj ective: To evaluate the effect of dihydromyricetin (DMY) on mouse melanoma cell B1 6 and reveal its mechanism of inhibiting melanin production. Method : The CCK8 method was used to screen the optimal concentration of DMY on the proliferation activity of B1 6 cells. Divided into control group and model group(α- MSH) positive drug group(α- MSH + arbutin) , administration group(α- MSH + DMY) , the proliferation activity of B1 6 cells in different groups was measured using the CCK8 method , the content of melanin and tyrosinas e in B1 6 cells was detected using ELISA method , the number of melanosomes in cells was observed using transmission electron microscopy , and the molecular docking method was used to predict the protein that DMY can reduce melanin content. Immunofluorescence and Western blot were used to measure the levels of melanin and tyrosinas e in B1 6 cells, the expression of α-MS H and MITF proteins . Result: The optimal concentration for DMY to inhibit B1 6 cell proliferation is 6 2 . 5 μmol · L- 1 . At the optimal concentration , compared with the model group , DMY can inhibit the proliferation of B1 6 cells, reduce melanin and tyrosinas e content , reduce the number of melanosomes, and inhibit α-MS H and MITF protein expression. Conclusion: Dihydromyricetin regulates α- The MSH/MITF pathway inhibits the production of melanin in B1 6 cells.
Key words: dihydromyricetin; B1 6 cells; mel ano genesis; α-MSH/MITF pathway
各种色素沉着性皮肤疾病 均 会 对 患 者 的 心 理 和 生理健康造成严重影响[1] 。 因此 ,抑制黑色素生成 一 直是医学和美容治疗 研 究 的 重 要 目 标 。 现 有 治 疗 方 式包括全身用药 、局部 用 药 和 激 光 治 疗 , 但 这 些 方 法 存在色素分泌失调 、遗传毒性 、皮肤毒性等风险 ,并且 激光治疗费用高昂且可能损伤皮肤屏障 。 因此 , 寻找 新的 、安 全 、高 效 的 色 素 沉 着 抑 制 剂 尤 为 重 要[2 - 3] 。 二氢杨梅素(D HM) 是蛇葡萄属植物的主要生物活性 多酚[4] 。 已有研究表明 ,DMY 具有多种功效 ,包括抗 菌 、抗炎 、心脏保护 、改善胰岛素抵抗 、抗氧化 、抗癌 、 降血压等[5 - 8] 。然而 ,对于其在抑制黑色素产生方面 的作用机制 , 以及其对 小 鼠 黑 色 素 瘤 细 胞 的 影 响 , 尚 未有相关研究报道 。本研究通过 B1 6 细胞模型 ,该细 胞具有与人体正常黑色素细胞 相 似 的 结 构 和 黑 色 素 合成功能 ,进而探讨 DMY 对小鼠黑色素瘤细胞的影 响 ,并揭示其抑制黑色素产生的机制[9] 。
1 材料与方法
1 . 1 试剂与仪器
小鼠黑色素瘤细胞 B1 6 购于中国典 型 培 养 物 保 藏中 心 ( 武 汉 ) 。 DMY ( 美 国 Sigma 公 司 , 纯 度 > 9 5 %) ,DMEM 培养基(美国 HyClone 公 司) , 胎 牛 血 清 FBS(杭 州 四 季 青 生 物 工 程 材 料 公 司) , 胰 蛋 白 酶 (美 国 HyClone 公 司 ) , 青 霉 素-链 霉 素 ( 美 国 ThermoFisher 公司) , PBS(美 国 HyClone 公 司) , 熊 果苷(上海源 叶 生 物 科 技 有 限 公 司 , 纯 度 > 9 8 %) ,α- MSH(美国 Sigma 公司 ,纯度 > 9 8 %) , CCK8 试剂盒 (南京建成生物工程研究所) 黑色素及 酪 氨 酸 酶 酶 联 免疫 ELISA 试 剂 盒(武 汉 博 士 德 生 物 工 程 公 司) , β- actin(北京博 奥 森 生 物 科 技 有 限 公 司) ,α-MSH 蛋 白 激酶(北京博奥森生物科技有限公司) , MITF 蛋白激 酶(北京博奥森生物科技有限公司) 。
二氧化碳培养箱(日本三洋公司) ,SDS 凝胶电泳及 转印装置(北京六一生物科技有限公司 ,) Multifuge XIR 台式冷冻离心机(美国 ThermoFisher 公司) ,荧光倒置显 微镜(上海好康生物科技有限公司) ,透射电子显微镜(香 港 FEI 公司) 。
1 . 2 试验方法
1 . 2 . 1 细胞培养及分组给药
B1 6 细 胞 培 养 于 DMEM 完 全 培 养 基 (含 1 0 % FBS ,1 %青霉素-链霉素) 中 ,于 3 7 ℃ 、5 %CO2 、饱和湿 度的培养箱内 培 养 。 根 据 细 胞 的 生 长 状 态 , 每 2 ~ 3天用胰蛋白酶消化后 传 代 培 养 。 将 细 胞 分 成 对 照 组 和给药 组 , 给 药 组 DMY 浓 度 为 为 5 0 0 μmol · L- 1 、 2 5 0 μmol · L- 1 、1 2 5 μmol · L- 1 、6 2 . 5 μmol · L- 1 、 3 0 μmol · L- 1 、1 5 μmol · L- 1 、7 . 5 μmol · L- 1 。 筛 选 最佳 DMY 给 药 浓 度 , 分 组 为 对 照 组 、模 型 组 ( α- MSH ,3 0 0 nmol · L- 1 ) 、阳 性 药 组 ( 熊 果 苷 , 2 0 0 μmol · L- 1 ) 给药组(DMY) 。
1 . 2 . 2 细胞增殖率
取处于对数生长期的细胞进行分组和给药 ,取处 于对数生长期的 B1 6 细胞 ,调整细胞密度为(5 ~ 6) × 1 0 5 个 · mL- 1 接种于 9 6 孔板中 ,培养 2 4 h ,弃去培养 基 ,加入含不同浓度药 物 的 培 养 基 , 每 组 药 物 设 5 个 复孔 ,重复三块板 ,每块板子设只含培养基的空白组 , 继续培 养 2 4 h , 弃 去 培 养 基 , PBS 清 洗 3 次 , 加 入 含 1 0 %的 CCK8 的培养基 1 0 0 μL ,避光 ,3 7 ℃下孵育 4 h 。 在 5 7 0 nm 处测每组吸光值 ,计算细胞抑制率 。
抑制率%=1-A给药组-A空白组/A对照组-A空白组×100%
1 . 2 . 3 黑色素及酪氨酸蛋白酶含量测定
对 B1 6 细胞进行培养 ,定期 观 察 细 胞 密 度 , 及 时 更换细胞培养液 , 当细 胞 处 于 对 数 生 长 期 上 升 期 , 即 培养皿中的细胞密度达到 8 0 % ~ 9 0 %时 ,接种到 6 孔 板中 ,细 胞 接 种 密 度 为 1 0 × 1 0 3 细 胞/孔 , 孵 育 2 4 h (3 7 ℃ ,5 %CO2 ) , 按 照 分 组 进 行 相 应 处 理 , 继 续 培 养 2 4 h 。 吸弃培养基 ,用 PBS 清洗 3 次 ,按照黑色素及 酪氨酸蛋白酶 ELISA 试剂盒操作说明测定不同组中 黑色素及酪氨酸蛋白酶含量 。
1 . 2 . 4 透射电镜检测黑素小体数量
将电镜专用玻片放入到 6 孔板中 , 以每孔 1 0 0 0 0 0 ~ 2 0 0 0 0 0 个 细 胞 浓 度 接 种 B1 6 细 胞 , 将 细 胞 放 在 培 养箱中培养 2 4 h(3 7 ℃ ,5 %CO2 ) ,按照分组进行相应 处理 ,继续培养 2 4 h 。用 0 . 2 5 %胰蛋白酶消化细胞 , 8 0 0 rpm ,离心 5 min ,使离心管底部形成松散的样品 团块 , 吸去大部 分 上 清 液 保 留 1 . 5 mL 液 体 , 将 团 块 与剩下液体吹打均匀 ,转移至 1 . 5 mL EP 管中 , 1 2 0 0 rpm ,离 心 1 0 min , 吸 弃 上 清 , 沿 管 壁 轻 轻 加 入 固 定 液 ,4 ℃保存 ,择期用透射电镜拍照观察 。
1 . 2 . 5 分子对接
首先从 PDB 数 据 库 提 取 α-MSH 和 MITF 的 蛋 白晶 体 结 构 , α-MSH 的 PDB ID 为 4 0 6 6 , MITF 的 PDB ID 为 6 FX5 ,然后将 DMY 结构的 mol2 格式 ,输 入到 ICM1 3 . 8 . 1 软件进行靶点模拟对接 。
1. 2. 6 免疫荧光法
将 B16 细胞按照 “1. 8 ”中培养方法培养 ,培养处 理好 后 的 6 孔 板 ,在 室 温 下 用 4%的 多 聚 甲 醛 固 定 20min。取 出 细 胞 爬 片 , 用 PBS 清 洗 3 次 , 0. 5% Triton X-100 室温通透 20min ,PBS 清洗 3 次 ,每次 3min ,吸干纸吸干 PBS ,在玻片上滴加正常山羊血清 , 室温封闭 30min。吸干封闭液 ,每张玻片加足够量的 α-MSH 蛋白抗体 ,4℃孵 育 过 夜 。PBS 清 洗 3 次 ,每 次 3min ,加稀释好的山羊抗兔 ,37℃孵育 1h ,PBS 清 洗 3 次 ,每次 3min。DAPI 复染细胞核 ,避光 ,室温孵 育 5min ,PBS 避光清洗 3 次 ,每次 3min ,加抗荧光淬 灭剂封片 ,荧光倒置显微镜拍照 。
1. 2. 7 Western blot
收集实 验 细 胞 ,RIPA 裂 解 B16 细 胞 提 取 蛋 白 , BCA 法 进 行 蛋 白 浓 度 定 量 ,加 足 量 电 泳 液 上 样、电 泳、转膜、封闭 1h。4℃下 一 抗(MITF 1 :1000 稀 释、 β-actin 1 :50 000 稀释)孵育过夜 ,TBST 清洗 3 次 ,室 温孵育二抗(1 :10000 稀释)2h ,TBST 清洗 PVDF 膜 3 次 ,于凝胶图形成像、拍照 。
1. 3 统计学分析
本研究采用 GraphPad Prism 5 作为作图软件 ,同时 对实验数据进行分析 。计量资料数据采用均数 ±标准差 表示 ,组间比较采用单因素方差分析(one-way anova) ,事 后两两比较采用 LSD 法。当 P<0. 05 ,P<0. 001 ,P< 0. 0001均认为差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 DMY 对 B16 细胞的影响
不同浓度(500、250、125、62. 5、30、15、7. 5μmol ·L-1 )的 DMY对 B16 细胞进行处理 ,浓度为 500、250、125、62. 5μmol ·L-1 的 DMY与对照组相比 ,均具有显著性差异(图 1)。 选择 62. 5μmol ·L-1 的 DMY作为最佳给药浓度。
如图 2 , 与对照组相比 ,模型组中 B16 细胞的存 活率显著升高(P<0. 05) ,说明造模 成 功 ,α-MSH 能 够增加 B16 细胞的存活率 。 当给予阳性药物熊 果 苷 和 DMY 干预后 ,与 模 型 组 相 比 ,能 够 显 著 降 低 B16 细胞的存活率 ,并且 DMY 组中的 B16 细胞存活率比 熊果苷组更低 。62. 5μmol · L- 1 DMY 具有显著抑制 B16 细胞的作用 。
2. 2 DMY 对 B16 细胞中黑色素及酪氨酸酶的影响
酪氨酸酶的含量和活性直接与黑色素含量相关 , 如图 3A 所示 ,与 对 照 组 比 较 ,模 型 组 B16 细 胞 中 的 黑色 素 含 量 显 著 增 加 (P < 0. 05) , 而 阳 性 药 (P < 0. 01)和 DMY(P<0. 01)干预显著减少 α-MSH 诱导 的 B16 细胞中黑素生成 。不同组别 B16 细胞中的酪 氨酸酶含量结果与黑色素含量趋势一致(图 3B)。
2. 3 DMY 对 B16 细胞中黑素小体的影响
如图 4 ,透射显微镜检测模型组细胞中的黑素小 体数量与对照组相比显著增多 ,而 62. 5μmol/L DMY 干预的 B16 细胞中黑素小体数量相较于模型组明显 减少 。
2. 4 DMY 对 B16 细胞可能作用靶点预测
分子对接结果(图 5) 表明 ,DMY 能够与 α-MSH 蛋 白 的 THR-210、AGR-213、SER-246、MET-247、 ASP-212 及 SER-238 残 基 对 接 成 功 , DMY 能 够 与 MITF 蛋白的 GLU-275 残基对接成功 。对接结果表 明 :DMY 进入 α-MSH 蛋白及 MITF 蛋白的疏水腔 , 可能形成空间位阻效应 ,阻碍其他底物进入蛋白活性口袋;DMY 可能在活性中心部位与两个蛋白 残 基 发 生非共价结合 ,改变蛋 白 质 的 活 性 中 心 构 象 ,从 而 降 低蛋白表达 。
2. 5 DMY 对 B16 细胞作用机制研究
如图 6A ,免疫荧光结果显示模 型 组 B16 细 胞 中 α-MSH 绿色荧光表达量明显高于熊果苷组 及 DMY 给药组 B16 细 胞 中 荧 光 表 达 量 。Western blot 结 果 (图 6B、C)显示 ,与对照组相比 ,模型组中 MITF 蛋白 表达量显著 升 高(P< 0. 05) ,而 给 予 熊 果 苷 和 DMY 干预后 MITF 蛋白表达量显著降低(P<0. 01)。
3 讨论
皮肤色素沉着主要取决于皮肤中黑色素的含量 , 过量的黑色素会导致 皮 肤 颜 色 加 深 。复 方 熊 果 苷 乳 膏是已经上市的抑制色素沉着的药物代表之 一 ,但有 研究表明其可能导致接触性皮炎 ,且症状与浓度呈正 相关[1 0] 。熊果苷导致接触性皮炎的原因是其在 一 定条件下可分 解 成 氢 醌[1 1] , 因 此 进 一 步 寻 找 低 毒 高 效 的抑制色素沉着化合 物 至 关 重 要 。本 研 究 中 熊 果 苷 作为阳性对照药物 ,确实具有显著的抑制黑色素瘤增 殖及抑制色素沉着的作用 ,但二 氢杨梅素抑制黑色素 产生的作用比熊果苷更佳显著 。
在哺乳动物中 ,黑素的生成是 一 个复杂的过程 , 涉及多个酶促和非酶促化学反应 ,产生两种不同类型 的黑色素 :红-黄色的嗜黑色素和棕-黑色的真黑色素 。 多巴醌是这两种黑色素的共同前体 ,其产生受到酪氨 酸酶(TYR) 的调控[1 2] 。黑素细胞性小眼相关转录因 子(MITF)是色素生成的主要调节因子 ,可以调控合 成黑色素所需的三种关键色素沉着酶 :TYR、酪氨酸 酶 相 关 蛋 白 1 (TYRP1) 和 酪 氨 酸 酶 相 关 蛋 白 2 (TYRP2)[1 3] 。 α-黑色素细胞刺激激素(α-MSH) 由角 质细胞分泌 ,可以到达黑色素细胞并通过 一 系列反应 产生黑 色 素 , 它 位 于 MITF 蛋 白 的 上 游 , 能 够 调 节 MITF 蛋白的表达[1 4] 。本研究结果表明 ,二氢杨梅素 可以抑制 B16 细胞中 α-MSH/MITF 信号通路 。
综上所 述 ,本 研 究 发 现 DMY 能 够 通 过 调 节 α- MSH/MITF 抑制黑色 素 产 生 ,为 DMY 应 用 于 开 发 黑色素沉着抑制剂提供了理论和实验支持 。
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