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【摘要】目的 探讨肝癌条达饮对 H22 荷瘤小鼠的抗肿瘤作用及对 B 淋巴细胞瘤 -2 (Bcl-2 )、 Bcl-2 相关 X 蛋白( Bax )、天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶 -3 (Caspase-3 ) 蛋白表达的影响。 方法 将 50 只无特定病原体级( SPF ) 雄性小鼠建立 H22 荷瘤小鼠模型， 按随 机数字表法分成正常组、模型组及肝癌条达饮低、中、高剂量组，每组 10 只。对比各组小鼠肿瘤体积、平均肿瘤质量、抑瘤率，Bax 、 Caspase-3、Bcl-2 mRNA 及蛋白相对表达量;苏木精-伊红( HE )染色观察各组小鼠肿瘤组织病理学变化。 结果 与模型组比， 肝癌条达饮 低、中、高剂量组小鼠平均肿瘤体积均更小， 平均肿瘤质量更低， 且高剂量组小鼠平均肿瘤质量均显著低于低、中剂量组(均 P<0.05 ); 肝癌条达饮低、中、高剂量组小鼠抑瘤率均呈升高趋势;与模型组比，肝癌条达饮低、中、高剂量组小鼠 Bax 、Caspase-3 mRNA 相对 表达量及蛋白相对表达量均呈逐渐升高趋势，Bcl-2 mRNA 相对表达量及蛋白相对表达量均呈逐渐降低趋势，且任意两组间经比较，差 异均有统计学意义(均 P<0.05 )。 结论 肝癌条达饮有较好的抑制肿瘤作用，其机制可能与上调 Bax 、Caspase-3 表达，下调 Bcl-2 表达 有关。
以肝细胞癌为主的原发性肝癌( hepatocellularcarcinoma，HCC)为常见的恶性肿瘤，该病早期不易被发 现，病情进展迅速，一经发现多数患者都处于中晚期，且 病情不稳定易复发转移。相关研究显示， HCC 全球每年 新发病例 85.4 万，中国 46.6 万，占比达 55%，是国内第 4 位常见恶性肿瘤及第 2 位肿瘤致死病因，严重影响患者 生活质量及生存率 [1] 。目前化疗药物在 HCC 的防治中未 见突破，并且肝功能障碍导致药物代谢异常，放大了化 疗药物的不良反应，甚至产生耐药性 [2]。HCC 属于中医学 的“积聚”“症瘕”“黄疸”等范畴，是由于七情内伤、饮 食劳倦，或邪毒内侵等，致脏腑气血亏虚，脾虚不运，气 滞、血瘀、湿热、痰毒等互结于肝所致 [3] 。肝癌条达饮是 江苏省名中医严冰治疗肝癌的经验方，提出健脾扶正、清 热解毒、活血化瘀、化痰散结、利水消肿等五种治疗大 法，即以“健脾扶正，五法统一”为原则自拟的方剂，包 括黄芪、蛇莓、夏枯草等中药，但目前其应用于肝癌的 相关研究较少。因此，本研究旨在探讨肝癌条达饮对 H22 荷瘤小鼠的抗肿瘤作用及 B 淋巴细胞瘤 -2 ( Bcl-2 )、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bax)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 -3 (Caspase-3 )mRNA 及蛋白表达的影响，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物、试剂、主要药物及仪器
1.1.1 实验动物 选择健康雄性无特定病原体级(SPF ) 小鼠 50 只，由上海灵畅生物科技有限公司提供，合格证 号：SYXK(苏) 2017-0040.动物饲养在 SPF 级动物房， 温度 20~25 ℃，相对湿度 50%~60%。适应性喂养 3 d 后 开始实验。实验过程中对动物的处置需符合《关于善待实 验动物的指导性意见》[4] 中的要求。
1.1.2 试剂与主要药物 苏木素 -伊红(HE)染色试剂 盒(南京凯基生物科技发展有限公司，批号：KGA224); TRIzol 试剂盒(美国 Invitrogen 公司，批号： 15596-026 ); cDNA 第一链合成试剂盒(立陶宛 Fermentas 有限公 司，批号：K1622 );全蛋白抽提试剂盒(南京凯基生物 科技发展生物有限公司，批号：KGP2100-025H01 ); 双 辛丁酸(BCA)蛋白含量检测试剂盒(南京凯基生物科 技发展生物有限公司， 批号：KGP903-691K32 );电化学 发光(ECL)检测试剂盒(南京先一行生物技术有限公 司，批号：P0018-542C );一抗稀释液(上海碧云天生物 技术公司，批号：P0023A );二抗稀释液(上海碧云天 生物技术公司，批号：P0023D)等。肝癌条达饮由安徽亳州市永刚饮片厂有限公司提供，经过淮安市中医院药 学部鉴定为正品，符合 2020 版《中国药典》规定，药方 组成：黄芪、蛇莓、夏枯草、泽漆、半边莲、石见穿各 30 g，莪术 15 g，白术、郁金各 12 g，炙水蛭 10 g，甘草 6 g。
1.1.3 主要仪器 全自动脱水机(德国 Leica 公司，型 号：ASP300S )，半自动切片机(德国 Leica 公司，型 号：RM2255 )，全自动染色机(德国 Leica 公司，型号： TS5015 );奥林巴斯光学显微镜(上海通灏光电科技有 限公司，型号：CX23 );Centrifuge 高速冷冻离心机(德 国 Eppendorf 公司，型号： 5804R );紫外光度仪(日本 SHIMADZU，型号：UV-2450 );荧光定量聚合酶链式反应 ( PCR)循环仪(中国中山达安，型号：MDA7600);凝胶 成像仪(美国 BIO-RAD 公司，型号：Gel Doc XR);分光 光度计(日本 SHIMADZ 公司，型号：UV-2540 );高速冷 冻离心机(美国科俊仪器公司，型号：SH03014);Western 电泳仪(美国 BIO-RAD 公司，型号： 164-5051 )。
1.2 分组与造模方法 取生长状态良好的 H22 细胞，将 细胞悬液( 1×107 个 /mL)接种于小鼠腹腔( 0.2 mL/ 只)， 腹水传代 3 次。脱颈处死已接种 H22 瘤种 11 d、腹部隆 起明显的第 3 代腹水瘤小鼠，取腹腔瘤液(无明显血性， 呈乳白色)，生理盐水稀释，800 r/min 离心 5 min，弃上清 得肿瘤细胞，生理盐水制备细胞悬液( 1.0×107 个 /mL )， 接种于小鼠右腋皮下(0.2 mL/ 只)，第 4 天后摸到小鼠腋 下约绿豆大小的硬块则为造模成功。造模完成后，将小鼠 随机分成正常组、模型组及肝癌条达饮低、中、高剂量 组，各 10 只，肝癌条达饮低、中、高剂量组小鼠分别予 以 16、32、64 g/kg 体质量肝癌条达饮灌胃， 1 次 /d，正常组和 模型组则每天给予同等体积的生理盐水灌胃，各组均连续 干预 15 d。
1.3 观察指标 ①各组小鼠肿瘤生长指标。小鼠采血 后，颈椎脱臼处死，剥离肿瘤，分析天平称重，计算各 组小鼠肿瘤体积与抑瘤率。抑瘤率(%)=(模型组平均 瘤重 - 给药组平均瘤重)/ 模型组平均瘤重 ×100%。②各 组小鼠肿瘤组织病理变化。建模完成，每组随机取 1 只小鼠，经二氧化碳处死，进行肿瘤组织病理切片， 10% 中 性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，4 μm 切片，HE 染色观 察肿瘤组织病理学变化。③荧光定量 PCR 法及蛋白免 疫印迹法( WB )法分别监测小鼠肝脏组织 Bcl-2、Bax、 Caspase-3 mRNA 及蛋白的表达;取小鼠肝脏通过 Rrizol 法提取总 RNA，反转录为 cDNA，定量 PCR，反应条件 为预变性 95 ℃、5 min，95 ℃ 变性 15 s，60 ℃ 退火 20 s，40 个循环，PCR 仪采集荧光信号，计算 2-ΔΔCt 值表示 mRNA 的相对表达含量。放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解法提 取肝脏总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度，SDA-PAGE 凝胶电 泳，将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后，封闭 1 h( 5% 脱脂奶粉)，一抗稀释 1 000 倍，β-actin 抗体稀释 4 000 倍， 4 ℃ 摇床摇荡孵育过夜，聚丁二酸对苯二甲酸丁二醇共聚 酯(PBST)漂洗滤膜 4 次，5min/ 次;将二抗稀释5 000 倍， 室温下摇荡孵育 1~2 h，然后用 PBST 充分洗膜，漂洗 5 次，5min/ 次，然后进行曝光，直至出现最佳条带。规定以 模型组数值为参照，以模型组的表达量为 1.其他组的蛋白表达量除以模型组蛋白表达量，计算下面 3 个剂量组的 数值。
1.4 统计学方法 通过 SPSS 22.0 统计学软件分析数据， 计量资料经 S -W 法检验均符合正态分布且方差齐，以 ( x±s) 表示，行 t检验，多组间比较采用重复测量方差分 析;计数资料以 [ 例 (%)] 表示，行 χ2 检验。以 P<0.05 为 差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组小鼠肿瘤生长指标比较 与模型组比，肝癌条 达饮低、中、高剂量组小鼠平均肿瘤体积均显著减小， 平均肿瘤质量显著降低，且高剂量组小鼠平均肿瘤质量 均显著低于低、中剂量组，差异均有统计学意义(均 P<0.05 );肝癌条达饮低、中、高剂量组小鼠抑瘤率均呈 升高趋势，见表 1.
2.2 各组小鼠肿瘤免疫组织化学染色切片 显微镜下 HE 切片染色结果可见，正常小鼠正常细胞分布均匀，未见肿 瘤细胞，见图 1-A ;模型组小鼠呈现大量的肿瘤细胞并显示肿瘤细胞团体积大，肿瘤细胞排列密集，形态大小不 一，核分裂象多，见图 1-B ;肝癌调达饮低、中、高剂量 均显著促进肿瘤细胞死亡，减少肿瘤细胞数，且呈浓度依 赖性变化，见图 1-C、D、E。
2.3 各组小鼠肿瘤组织 Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 及蛋 白相对表达量比较 与模型组比，肝癌条达饮低、中、高 剂量组小鼠 Bax、Caspase-3 mRNA 相对表达量及蛋白相对 表达量均呈逐渐升高趋势，Bcl-2 mRNA 相对表达量与蛋白 相对表达量均呈逐渐降低趋势，但任意两组间经比较，差 异均有统计学意义(均 P<0.05)，见表 2.
3 讨论
目前对于HCC 的治疗仍以外科手术治疗为主， 包括肝 切除和肝移植术，但由于肝癌起病隐匿、发展迅速、恶性 程度高，临床确诊时患者已多属于中、晚期，且常由于肝 癌患者肝功能储备差、肝内转移及播散而失去外科手术治 疗的机会，而介入治疗、局部消融治疗、放射治疗及生物 靶向治疗等措施，虽增加了肝癌的治疗方式，但其明显的 不良反应及应用局限无法忽视。
中医认为，HCC 的主要病机为正虚于内，湿、热、 毒、瘀、痰相互胶结， 日久积而成块;肝、脾、肾亏虚， 脏腑功能失调是肝癌的发病基础，治疗肝癌首当扶正 [5]。 肝癌条达饮中黄芪可补气、解毒排脓、利尿消肿;白术可 补气健脾、燥湿利水;茯苓可利水消肿、健脾止泻，郁金可活血止痛、行气解郁，夏枯草可清泻肝火、散结消肿， 蛇莓可清热凉血、消肿解毒;泽漆可行水消肿、解毒; 半边莲可清热解毒、利尿消肿;莪术可消积止痛、行气破 血;炙水蛭可止痛、活血通经;石见穿可活血化瘀、清热 解毒;甘草可补脾益气，清热解毒，上述药物联用，共奏 扶正固本、活血化瘀、化痰散结、软坚散结、活血消肿之 功效。相关研究认为，HCC 的病机特点为本虚标实，本 虚主要是肝、脾、肾亏虚，标实主要为湿、热、毒、瘀、 痰合而为患，病初在肝脾，当清肝养肝为主，佐以健脾以 防变;自拟肝癌条达饮，结果显示，肝癌条达饮能够改善 患者中医临床证候，防治癌症复发和转移，增强患者的机 体免疫力，促进患者康复;同时还可减轻化疗所引起的 疼痛症状，且未见明显不良反应，临床应用安全，疗效 确切 [6]。
本研究中，与模型组比，肝癌条达饮低、中、高剂量 组小鼠平均肿瘤体积均显著减小，平均肿瘤质量显著降低， 且高剂量组小鼠平均肿瘤质量均显著低于低、中剂量组; 肝癌条达饮低、中、高剂量组小鼠抑瘤率均呈升高趋势， 提示低、中、高剂量肝癌条达饮对 H22 荷瘤小鼠均具有明 显的抗肿瘤活性， 且其抑瘤作用与剂量呈正相关。 HE 染色 法对 H22 荷瘤小鼠的肿瘤组织进行观察， 检测各小鼠体内 细胞凋亡的情况，结果表明，H22 荷瘤小鼠模型组肿瘤细 胞核清晰且排列紧密，病理性核分裂像多，肿瘤细胞凋亡 较少;而肝癌条达饮低、中、高剂量组干预后，均出现了 不同程度的核破裂， 也提示了肝癌条达饮对 H22 荷瘤小鼠 的抑瘤活性呈剂量依赖性。
有研究表明， HCC 存在多种信号通路的异常激活， 其 中包括表皮生长因子受体、肝细胞生长因子及凋亡信号通 路调控机制紊乱 [7-8]。细胞凋亡是细胞在特定条件下，受 多种基因调控发生的程序化死亡，是机体关键自稳调节机 制，细胞凋亡与凋亡因子密切相关，Caspase-3 是 Caspase 级联反应下游的关键凋亡因子，而 Bax、Bcl-2 均是 Bcl-2 家族中具有代表性的促进凋亡和抗凋亡的因子。相关研究 显示，黄芪配伍莪术可增强促凋亡蛋白 Caspases、Bax 等 的表达，阻碍凋亡蛋白 Bcl 的表达，抑制端粒酶的活性，诱导碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶的表达等 [9] 。现代药理学研究表明，蛇莓酚提取物可以抑制肝癌细胞增殖，激发细胞亡， 下调 Bcl-2.上调 Bax，活化 Caspase-3.诱导细胞凋亡， 在体内可以抑制肿瘤生长， 延长荷瘤鼠生存时间 [10];泽漆乙酸乙酯粗提物可抑制人肝癌细胞中基质金属蛋白酶 -2 ( MMP-2) 、细胞周期蛋白 D1 ( CyclinD1 )及 Bcl-2的表达， 而对 Bax、Caspase-3 的表达有促进作用， 且呈剂量依赖性 [11]。为深入探究肝癌条达饮的抑瘤作用机制， 本研究用 PCR 法与 WB 法对 H22 荷瘤小鼠肿瘤组织 Bax、Casepase3、Bcl-2 表达情况进行测定，结果显示，肝癌条达饮低、中、高剂量组能提高促凋亡因子 Bax、Casepase3表达，降低抗凋亡因子 Bcl-2 表达;推测出肝癌条达饮通过控制细胞凋亡相关重要基因( Bax、Bcl-2、Caspase-3 )表达，降低抗凋亡因子 Bcl-2 表达;推测出肝癌条达饮通过控制细胞凋亡相关重要基因( Bax、Bcl-2、Caspase-3 )综上，肝癌条达饮可通过上调 Bax、caspase-3.下调Bcl-2 蛋白表达来诱导 H22 荷瘤小鼠肝癌细胞凋亡，且随着剂量的增加，抗肿瘤效果更显著。但目前关于肝癌条达饮的相关研究报道较少，其在体内的抗肿瘤作用机制也十分复杂，因此仍需进一步开展深入研究。
参 考 文 献
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