SCI论文（www.lunwensci.com）
摘要：目的 建构对人类表皮生长因子样结构域 7 ( EGFL7 )基因真核表达载体以及稳定性转染 EA.hy926 细胞系的科学评价体系。 方法 采用实时荧光定量聚合酶链式反应( PCR ) 方法获得 EGFL7 的开放阅读框( ORF ) ，借助双酶切方式， 使得 EGFL7 能够被克隆至 真核表达载体(pEGFP-N1 )中并获取到已经重组好的质粒 pEGFP-N1-EGFL7.在进一步接受测序和鉴定处理后， 借助电转仪对 EA.hy926 细胞进行转染，然后通过 G418 筛查进而建构起稳定性转染 EA.hy926 细胞系。使用实时荧光定量 PCR 和免疫印迹法检测 EGFL7 基因及 蛋白在 EA.hy926 细胞系中的表达。结果 转染 EGFL7 的 EA.hy926 细胞的 EGFL7 基因和蛋白水平均明显高于对照质粒转染组和空白对 照组(P<0.05 )。 结论 成功建构人 EGFL7 真核表达载体并鉴定了 EGFL7 在 EA.hy926 细胞系中的过表达，为探讨 EGFL7 对早产儿支 气管肺发育不良的影响奠定基础。
关键词： EGFL7.真核表达载体,稳定转染,EA.hy926 细胞系
Construction of eukaryotic expression vector of human EGFL7 and establishment of stably transfected EA.hy926 cell line
DING Yue，HUANG Weiming，TANG Lijun
(Department of Neonatology, The South Hospital of Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515. China )
Abstract: Objective To construct a scientific evaluation system for human epidermal growth factor-like domain 7(EGFL7) eukaryotic expression vector and stably transfected EA.hy926 cell line. Methods The open reading frame (ORF) of EGFL7 obtained by real-time quantitative PCR, and EGFL7 could be cloned into the eukaryotic expression vector peGFP-N1 by double enzyme digestion method, and then the recombinant plasmid PEGFP-N1-EGFL7 was obtained. After receiving sequencing and identification, EA.hy926 cells were transfected with the aid of electrotransduction apparatus, and stable transfection EA.hy926 cell lines were constructed after G418 screening. The expression of EGFL7 gene and protein in EA.hy926 cell line was detected by real-time quantitative PCR and western blotting. Results The level of EGFL7 MRNA and protein in EA.hy926 cells transfected with EGFL7 was significantly higher than that in control group and blank control group(P<0.05). Conclusion The successful construction of human EGFL7 eukaryotic expression vector will lay a foundation for the study of the role of EGFL7 in preterm infants of bronchopulmonary dysplasia.
Keywords: EGFL7; Eukaryotic expression vector; Stable transfection; EA. hy926 cell line
支气管肺发育不良(broncho-pulmonary dysplasia，BPD ) 是极低出生体重儿长期氧疗、机械通气常见的肺部并发 症，有较高的致残率及死亡率 [1] ，存活儿常遗留肺功能损 伤及神经系统后遗症 [2] ，是早产极低体重儿并发症中救治 耗费最高的疾病。随着肺表面活性物质及无创呼吸机等的 应用 [3-4]，BPD 在病理特征表现上， 以肺泡以及肺微血管不 良发育为基础 [5] 。调控肺血管发育的生长因子紊乱可导致肺血管发育受阻进而影响肺泡正常发育。人类表皮生长因 子样结构域 7 ( EGFL7)是一种血管内皮特异分泌的新型 蛋白， 在高氧致新生大鼠 BPD 中表达下调， 有可能对 BPD 的发生发展有影响 [6] 。基于此，本研究建立针对人的真核 表达 EGFL7 的载体， 在此基础上进一步评价该载体是否能 稳定地转染 EA.hy926 细胞系， 从而为探究 EGFL7 对 BPD 的影响提供参考借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料 EA .hy926 细胞购自广州励德生物科技有限 公司，胎牛血清购自美国 Gibco 公司;质粒提取试剂盒、 G418 购自美国 invitrogen 公司;DNA 凝胶回收试剂盒购自 美国 OMEGA 公司;免抗人 EGFL7 多克隆抗体购自美国 santa cruz 公司;β-actin 抗体购于美国 Affinity 公司;实时 荧光定量 PCR( RT-PCR)试剂盒购于 QIAGEN 公司。
1.2 方法
1.2.1 RT-PCR 扩增 mTSARG3 基因开放阅读框 设 计 EGFL7 引物，扩增含 EGFL7 开放阅读框的 822bp 序 列，琼脂糖凝胶通过电泳仪(美国伯乐公司，型号： 164- 5050)进行电泳，然后对收回后的胶进行分析。
1.2.2 pEGFP-N1-EGFL7 重组质粒的构建及鉴定 利 用 Hind Ⅲ以及 BamHI 对已经纯化后的 PCR 产物和 pEGFP-N1 质粒进行双酶切，将其转化成为 Ecoli DH5ɑ的 感受态细菌，借助药物筛选后以获得显示为阳性的克隆， 通过 PCR 扩增并进一步双酶切鉴定获得的阳性克隆， 在进 行测序后就可以具体对载体命名为 pEGFP-N1-EGFL7.
1.2.3 pEGFP-N1-EGFL7 在 EA.hy26 细胞系中的瞬时转 染 EA.hy926 细胞融合至 80%~90% 时，将 pEGFP-N1- EGFL7 质粒通过电转仪(日本 BEX 公司，型号：BEX 系 列 CUY21EDIT Ⅱ型)转染 EA.hy926 细胞。荧光显微镜 下观察转染情况。
1.2.4 建立稳定转染人 EGFL7 的 EA.hy926 细胞系 筛 选 G418 浓度即细胞全部死亡的最低浓度( 500 μg/mL)。 EA.hy926 细胞转染后 48 h，改含 G418 的 DMEM 培养基 培养，从中筛选出克隆物质，为获得单克隆的细胞系对 上述克隆物进行扩增培养。将 pEGFP-N1 空白质粒导入 EA.hy926 细胞中，并将此细胞作为阴性对照组。
1.2.5 RT- PCR 检测转染细胞中 EGFL7 基因 使用 Trizol 试剂盒进行 RNA 提取，利用微量分光光度法测定 RNA 含量及纯度。利用琼脂糖凝胶电泳的检测方式，对 18S RNA、28S RNA 进行测定，测定的内容主要是证实 RNA 序列完整性。借助逆转录的方式，合成 cDNA 的第 一链，利用这种参考模板做荧光定量 RT-PCR 工作。实时 ( Real-time)PCR 数据采用 2- △CT 相对定量方法处理。
1.2.6 免疫印迹法( WB )鉴定 EGFL7 蛋白表达 总蛋 白加入到 10 μL 的 5 × 样品缓冲液(比例为 4 ∶ 1 )， 煮 沸后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，50 g.L- 1 BSA 室温封闭 2h 后加入 EGFL7 抗体(稀释浓度 为 l ∶400 )，4 ℃冷库孵育过夜，用含 TwEEN20 的 TBST 在摇床上充分洗涤 PVDF 膜，每次 10 min，前后共 3 次。 然后加入经 l ∶ 10 000 稀释的二抗，将稀释好的二抗置 入 22 ℃~26 ℃室温下，摇床上持续摇晃约 60 min，借助TBST 洗涤 PVDF 膜 3 次，利用电化学发光法测定并且做 显色处理，之后针对结果予以吸光度的扫描检查。
1.2.7 统计学方法 用 SPSS 21.0 统计学软件进行数据处 理。数据均进行正态检验，两样本间比较采用 t 检验;两 样本以上之间的比较，则检验方差是否齐性，若方差齐 性，则采用方差分析，组内多重间比较行 LSD 检验，反 之则用 Welch 检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RT-PCR 扩增 mTSARG3 基因开放阅读框结果 从 脐静脉内皮细胞的 cDNA 文库中扩增 EGFL7 的开放阅读 框，电泳分析琼脂糖凝胶发现： 819bp 为基因片段的大 小，这一结果与预期的基本一致，见图 1.2.2 pEGFP-N1-EGFL7 重组质粒双酶切及测序鉴定 pEGFP-N1-EGFL7 重组质粒 1 、2 借助双酶切下 7kd 左 右、819bp 左右条带(图 2)，经测序后证实 DNA 序列与 GenBank 中 EGFL7 序列一致，表明重组质粒构建成功。
2.3 稳定转染细胞系的鉴定
2 . 3 . 1 RT- P CR 检测 E G F L 7 m RNA 设 对 照 质粒 转染的 EA . hy926 细胞 EGFL7mRNA 相对表达量 (relativequantity，RQ)为 l，N1-EA.hy926 和 hEGFL7-EA. hy926 两组差异有统计学意义(t= -5.975.P= 0.028)， 见 表 1.
2.3.2 WB 检测 EGFL7 蛋白量 hEGFL7-EA .hy926 组 EGFL7 蛋白量明显高于空白对照组和 N1-EA .hy926 组， 经过统计学方法，差异均有统计学意义(P<0.001 )，见图3、表 2.
3 讨论
BPD 是早产儿比较严重的慢性呼吸系统疾病， 可导致 患儿长时间脱氧困难，对肺部及气道造成持续的慢性损伤， 严重者可出现肺动脉高压甚至死亡 [1] 。即使存活，后期可 能因感染或哮喘等原因反复住院从而导致预防不良。BPD 的确切病因及机制尚未明确。因此， 迫切需了解 BPD 的发 生机制从而寻求有效的防治措施减少早产儿BPD 发生率。 肺血管发育紊乱及肺泡化阻滞是 BPD 发生发展的关键事 件。既往学者们关注的主要领域是肺泡化损伤， 但对 BPD 的预防及治疗并未取得明显成效。近年来认为 BPD 是由于 肺微血管发育不良导致肺泡发育异常的“血管发育障碍假 说”[7]。因此， 目前认为肺血管分泌的多种因子在肺微血管 和肺泡正常发育中起重要作用。探索血管生长因子在 BPD 中的作用可望为 BPD 的防治开辟新的途径。EGFL7 是新近发现的在肺血管形成和生成的过程中均起重要作用的蛋 白，在血管内皮细胞中特异表达，通过自主分泌或者旁边 组织分泌刺激血管生成 [8]。EGFL7 可以抑制平滑肌细胞迁 移，促进血管内皮细胞迁移、黏附、增殖在正常血管管腔 形成中发挥了关键作用 [9]。EGFL7 敲除小鼠会出现外周出 血、循环发育缺陷 [10]。EGFL7 过表达则导致血管结构异常 及血管稳态受损 [9]。这提示 EGFL7 是血管发育中的关键蛋 白，其是否参与了 BPD 的发病过程，国内外报道较少。
我们从人的脐静脉内皮细胞 cDNA 文库中获得扩增 EGFL7 的 ORF，经过双酶切将其克隆到 pEGFP-N1 中， 得到重组表达质粒 pEGFP-N1-EGFL7.利用电穿孔法最终 建立稳定转染的 EA.hy926 细胞系。使用 RT-PCR 及蛋白 质印迹法检测 EGFL7 在稳定转染 EA.hy926 细胞系中的基 因及蛋白水平。这一结果显示：研究成功地建立了稳定整 合 pEGFP-N1-EGFL7 载体的 EA.hy926 细胞系。我们前期 研究发现：新生鼠在 60% 的氧气中持续暴露 14 d 可以模 拟 BPD 的发生发展过程，通过建立此模型我们观察到肺 部 EGFL7 基因和蛋白表达水平明显低于正常组，下调值 同肺部微血管的密度降低有紧密相关性，这一结果则提示 EGFL7 可能同肺部的微血管发育存在障碍有较大联系 [6]。
此外， 在高氧的暴露下， 血管内皮细胞的 EGFL7 蛋白表达 量明显低于正常组并且高氧组的内皮细胞凋亡明显增加， EGFL7 蛋白表达增加可避免血管内皮细胞发生凋亡 [11]。高 表达EGFL7 是否可减少内皮细胞凋亡进而促进血管发育， 需深入研究明确。 EGFL7 在多种炎症及血管生成中也扮演 了重要的角色。在 EGFL7 敲除的体外血管模型中， EGFL7 敲除后会抑制血管生成，同时血管屏障功能受损并导致炎 症反应 [12]。EGFL7 敲除鼠可导致神经系统免疫反应， 重组 EGFL7 蛋白治疗则可减轻上述炎症反应 [13]。在脂多糖诱导 的炎症反应中， 鼠肺组织血管内皮细胞中的 EGFL7 表达减 少，上调 EGFL7 可减少白细胞在内皮细胞的黏附 [14] 。这 表明 EGFL7 有可能通过减轻炎症反应增加血管生成。肺部 高表达 EGFL7 是否能减轻炎症反应促进血管及肺泡发育 进而发挥对 BPD 的保护作用，国内外尚未见报道。
综上所述，本研究通过建立能高表达 EGFL7 蛋白的 EA.hy926 细胞系，为下一步在体内外实验中探讨 EGFL7 在 BPD 中的作用及机制奠定基础。
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