黄花菜中酚类成分对过氧化氢诱导型,嗜铭细胞瘤PC12细胞 损伤的保护作用研究论文

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摘要：目的 研究黄花菜中酚类成分对过氧化氢(H2O2)诱导大鼠嗜铭细胞瘤(PC12)细胞损伤的保护作用及机制。方法 建立H2O2诱导 PC12损伤模型，采用MTT法检测细胞存活率和乳酸脱氢酶法(LDH)检测细胞损伤程度。将对数生长期细胞分为5个组，空白组、模型组、 黄花菜酚类成分低剂量组(1.25mg/mL)、中剂量组(2.5mg/mL)、高剂量组(5mg/mL)。按分组连续培养48h;采用MTT法检测其存活率， LDH法检测上层培养基中LDH释放率；利用文献中报道液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)检测细胞外液中多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、 乙酰胆碱(Ach)、y-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)、色氨酸(TRP)、5-羟色胺(5-HT)、5-羟色氨酸(5-HTP)、5-羟呷噪乙酸(HIAA) 9种神经递质的含量。结果 与空白组和模型组比较，黄花菜酚类成分的加入使细胞存活率由47.91%升高至76.02%, LDH释放率由300.85% 降低至145.61% (P<0.05)；细胞外液中神经递质含量也发生了明显的变化，9种神经递质分别发生了趋于空白组的变化，9种神经递质(DA、 NE、Ach、GABA、TPR、5-HT、5-HTP、5-HIAA)含量得到显著回调(户<0.05)。结论 黄花菜中酚类成分对H2O2诱导PC12细胞损伤的 保护作用，机制可能与调控PC 12细胞神经递质释放有关。

1.3细胞
 
      肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株（中国医学科学院细胞资源中心）。

2方法

2.1黄花菜中酚类成分的提取分离

        称取黄花菜粉末250g，置于5L圆底烧瓶中，加入2.5L的 90%乙醇，60T水浴中回流提取2h收集滤液，滤渣再用70%乙 醇在60T水浴中回流提取2次，每次1h。合并3次提取液，过 滤除去残渣，将滤液用旋转蒸发仪60T，200r/min条件下减压蒸 发，除去滤液中乙醇后加水至500mL溶解，加到AB-8大孔吸附 树脂柱色谱（1000g ）中，分别50%乙醇洗脱，将得到的馏分进一 步在Sephadex LH 20中进行分离，得到黄花菜中酚类成分，减压 浓缩，并冻干得干膏。根据文献中黄花菜酚类提取物的指纹图 谱选用芦丁作为对照品测定干膏中酚类成分为61.29%^［11］。

2.2 PC12细胞培养

        取出保存在液氮中冻存的PC12细胞，在37T水浴中迅速解 冻，冻存管75%酒精消毒后放入洁净工作台中，移液器吸取细胞 加至15mL离心管中，再加3mL培养基,1000r/min离心5min， 分离细胞和培养液，向细胞中加入1mL DMEM高糖培养基（含 10%胎牛血清和青霉素100U/mL、链霉素100^g/mL ）将细胞吹 打均匀，移至75cm²培养瓶中，加入12mL的DMEM高糖培养基 摇匀，置于37T、5%CO2细胞培养箱中培养。隔日换液，待细胞 长至80%满瓶时，用0.25%胰酶消化传代。传至3代细胞状态 良好时选取对数生长期的PC12细胞进行试验。

2.3 H2O2诱导PC 12细胞损伤模型的建立

        取对数生长期PC 12细胞，以5X10⁴个/mL,0.2m L接种于 96孔板中，放入37T、5% CO₂培养箱中孵育24h，弃去培养液， 加入浓度为 0（空白）、50、100、200、400、800Nmol/mL 的 H₂O₂ 的DMEM培养基200^L/孔，37T、5%CO₂培养箱中继续孵育 24h，弃去培养液，再向其中加入MTT （工作浓度为0.5mg/mL） 200以/孔,37r,5%CO₂培养箱中继续孵育4h,加入150以/孔 DMSO,在微孔板振摇器上避光振摇15min，酶标仪测定各孔吸 光度A值，计算细胞存活率。

       细胞存活率=人不同浓度H₂O₂模型组/A空白组X100%

2.4 MTT法检测细胞存活率

        取对数生长期的PC 12细胞，以5x10⁴mL^-1的密度接种于 96孔板中，每孔200以,放入37T、5% CO2培养箱中孵育24h后， 将细胞分为空白组、模型组、黄花菜酚类成分低剂量组（1.25mg/ mL）、中剂量组（2.5mg/mL）、高剂量组（5mg/mL）,每组5个复孔。 空白组细胞加入200^L的DMEM培养基，模型组和黄花菜酚类 成分组细胞加入200^L含200^mol/L H₂O₂的DMEM培养基， 37T、5% CO2培养箱中孵育24 h，吸走全部培养液，空白组和模 型组分别加入200^L新鲜DMEM培养基继续培养24h。黄花菜 酚类成分组细胞分别加入200^L含黄花菜酚类成分低、中、高浓 度（1.25、2.5、5mg/mL,以生药计）的培养基，孵育24h。吸取细 胞上清液后，向其加入200皿/孔0.5mg/mLMTT溶液继续孵育 4h。吸走MTT溶液，加入150叽DMSO,避光振摇10min,并用 酶标仪波长470 nm处的吸光度（A）值，计算细胞存活率。

         细胞存活率=A模型组/A空白组x100%

2.5黄花菜中酚类成分对PC 12细胞损伤的影响

         取对数生长期的PC12细胞，以5x10⁴mL^-1的密度接种于 96孔板中，每孔200皿,放入37T、5%COz培养箱中孵育24h后， 将细胞分为空白组、模型组、黄花菜酚类成分低剂量组（1.25mg/ mL）、中剂量组（2.5mg/mL）、高剂量组（5mg/mL）,每组5个复 孔。空白组细胞加入200^L的DMEM培养基，模型组和黄花菜 酚类成分组细胞加入200^L含200^mol/LH₂O₂的DMEM培养 基,37T、5%CO2培养箱中孵育24h,吸走全部培养液，空白组和 模型组分别加入200^L新鲜培养基继续培养24h。黄花菜酚类 成分组细胞分别加入200^ L含黄花菜酚类成分低、中、高浓度 （1.25、2.5、5mg/mL,以生药计）的DMEM培养基，孵育24h。吸 取细胞培养上清液，按照LDH试剂盒说明书操作检测LDH含 量，试验重复3次，细胞外液中LDH含量反映细胞损伤程度。

2.6检测PC12细胞外液中的神经递质含量

        取对数生长期的PC12细胞，经胰酶消化并用DMEM培养 基终止反应，以5x10⁴个/mL的密度接种于24孔板中进行培养， 每孔均匀加入1mL,放入37T、5% CO2的培养箱中孵育72h,每 24h换液1次，弃去培养基，细胞用200^L胰酶消化3min,再加 入200^LDMEM培养基终止消化,8000r/min离心5min,分离细 胞和培养液。培养液按1:2比例加入甲醇涡旋混匀，室温放置 10min, 12000r/min离心5min；取上清液1mL,加入内标液3mg/ mL 的 2,6-二羟基苯甲酸（2,6-Dihydroxybenzoicacid DHBA） 20^L （内标的加入为了有效的监控在提取的过程中是否会因为 失误造成的非特异性），冷冻干燥，得干品。测定前用含0.2%甲 酸的甲醇水（ 1:1 ）200^ L溶解,12000r・min^-1离心10min,得到细 胞外液，按照文献中LC-MS/MS分析指标和条件检测细胞外液 样品中9种待测物的含量^［111_o

2.7统计分析

        采用SPSS 17.0软件进行统计分析。数据以均值mean±SD 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检 验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3结果

3.1不同浓度H2O2对PC 12细胞存活率影响

        如图1所示，H2O2对PC 12细胞的损伤呈浓度和时间依赖 性上升，细胞存活率过高黄花菜酚类成分的加入起到的保护作 用显著性较低，细胞存活率过低细胞损伤程度太大黄花菜酚类 成分的加入起到的保护作用不明显，当H₂O₂浓度为200^mol/L, 与PC12作用24h,细胞存活率为49.21%。所以选择浓度为 200^mol/L的H₂O₂作为PC 12细胞损伤模型的造模浓度。



         MTT结果如图2显示，黄花菜中酚类成分对PC12细胞损伤 具有保护作用，与空白组比较模型组细胞存活率降低到47.15%, 而黄花菜酚类成分低剂量组（1.25 mg/mL）、中剂量组（2.5 mg/ mL）、高剂量组（5mg/mL）的加入分别将细胞存活率由49.21%提 高到58.36%,68.08%和76.02%,随着生药浓度的增加，其细胞存 活率也在增加，由此可知不仅酚类成分对PC12细胞具有保护作 用，而且酚类成分与对PC12细胞的保护作用具有剂量依赖性。



33黄花菜中酚类成分对细胞损伤的影响

        LDH检测结果如图2显示，与空白组比较细胞LDH释放率 模型组是空白组细胞3倍，与模型组比较黄花菜酚类成分低剂 量组(1.25 mg/mL )、中剂量组(2.5 mg/mL )、高剂量组(5mg/mL ) 的加入别将细胞LDH释放率降低至空白组的1.85.1.62和1.45 倍，随着生药浓度的增加，其细胞LDH释放率在减少，可知细胞 的损伤程度在降低；由此可知不仅酚类成分对PC12细胞具有保 护作用，而且酚类成分剂量越高PC12细胞损伤程度越小。




 3.4黄花菜中酚类成分对PCI 2细胞外液中神经递质含量的影响

       神经递质检测结果见表1, PC12细胞经过田。2处理细胞 受到损伤后与空白组比较，DA、NE、Ach、GABA、TRP、5-HT、 5-HTP和5-HIAA八种神经递质在细胞外液中的含量明显降 低，并具有显著性差异(户<0.01 )。而黄花菜酚类成分低剂量组 (1.25mg/mL )、中剂量组(2.5mg/mL )、高剂量组(5mg/mL )作用 后 PC12 细胞外液中 NE、Ach、GABA、TRP、5_HT、和 5-HIAA 含量明显升高(P<0.05, P<0.01 ),与模型组相比,有显著性差异; 在黄花菜中、高剂量组细胞外液中DA.5-HTP含量明显升高，有 显著性差异(P<0.05, P<0.01 );而在黄花菜低剂量组的细胞外 液中DA.5-HTP含量有上升趋势，无显著性差异;黄花菜酚类成 分剂量的增加，8中神经递质含量升高越明显。JO?处理后的 细胞外液中Glu的含量与空白组明显升高(P<0.05, P<0.01 ), 而黄花菜酚类成分的加入使细胞外液中Glu含量显著性降低 (P<0.05,P<0.01 )，并趋向于空白组变化。




3讨论

        近年研究发现，包括抑郁症在内的许多疾病都与氧化应激有 关^[12]_o H₂O₂作为强氧化剂，是建立体外细胞氧化应激损伤模型 的诱导剂。H2O2可穿过细胞膜、线粒体与细胞内的三价铁反应 产生活性氧(reactive oxygen species,ROS ) ^[13]_o大量活性氧的生 成远超出抗氧化系统的清除能力，导致ROS生成与抗氧化清除 作用失衡，引起神经细胞损伤，模拟抑郁症患者体内氧化应激状 态^[14]o LDH是一种胞浆酶，当细胞膜受到损伤时，LDH快速的 释放到细胞外，是检测细胞损伤的一个重要指标"％

         DA是一种与人类的情感、记忆密切相关神经递质，其减少、 失调是引起一些脑部疾病的重要原因^[16];NE是一种交感神经 节分泌的神经递质，研究发现NE缺失可能会导致精神分裂等 疾病【"I； GABA是中枢神经系统中重要的抑制性神经神经递质， 人体缺乏GABA时，会产生精神倦怠、烦躁不安等消极情绪^[18]; TRP代谢异常会引起精神分裂、抑郁症等精神疾病，色氨酸代谢 的正常化也是治疗精神疾病的关键^[19-^20];5-HT是大脑分泌的 一种激素，可以起到镇静安神的作用，它的缺乏会导致帕金森、 红斑狼疮、精神分裂、神经衰弱等疾病^[21];5-HTP是5-HT前身， 是缓解压力、改善睡眠的有效抗抑郁剂，能够维持身体处于正常 状态;5-HIAA是5-HT (代谢)生成的无生物活性酸性代谢终 产物，其含量能够间接反映5-HT变化。临床研究发现抑郁症 患者存在Glu代谢异常，并且重症抑郁患者的血小板对谷氨酸 敏感性增加Si。ACh含量与内分泌调节和对压力的情绪及生 理反应有关凶】。因此，本文选择上述几种神经递质作为评价氧 化应激损伤的指标。

         本研究结果显示，与空白组比较模型组细胞存活率下降至 49.12%,说明造模成功，模型组细胞外液中神经递质含量发生异 常变化 DA、NE、Ach、GABA、TRP.5-HT.5-HTP 和 5-HIAA 含 量明显降低，Glu显著升高；与模型组比较黄花菜酚类成分低、 中、高剂量组的神经递质含量异常得到明显的改善，DA、NE、 Ach、GABA、TRP,5-HT,5-HTP 和 5-HIAA 含量显著升高，Glu 含量明显降低，逐渐趋向于空白组正常细胞外液中神经递质含 量，以高剂量组效果更为显著;表明黄花菜中酚类成分对细胞损 伤导致的神经递质释放的异常起到调节作用。经本实验证实黄 花菜中酚类成分对山。2所致的氧化应激损伤细胞有保护作用， 并且其机制与调节损伤细胞中神经递质的释放相关。为进一步 研究天然多酚成分抗抑郁机理提供了科学依据。

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