SCI论文（www.lunwensci.com）:
摘要：目的 探讨黄芩甲苷对胆汁淤积性肝病小鼠的影响。方法 40 只雄性 SPF 级 C57BL/6 小鼠随机、平均分为正常对照组、模型 组、熊去氧胆酸组和黄芩甲苷组。动物通过自由喂食 0. 1% 利用喂食 3，5- 二乙氧基羰基 - 1，4- 二氢 -2，4，6- 三甲基吡啶( DDC ) 饲料建 立小鼠胆汁淤积性肝病模型， 于造模 5 d 后以灌胃方式给药， 连续给药 3 d ，1 次 /d。观察各组小鼠肝组织病理形态学变化， 检测肝组织炎 症因子 [ 肿瘤坏死因子 α ( TNF-α )、白介素 1β ( IL- 1β)、白介素 6 ( IL-6 ) 、和氧化应激指标 [ 丙二醛( MDA ) ] 超氧化歧化酶( SOD )、 谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-PX ) ] 水平，检测各组小鼠血清肝功能酶 [ 丙氨酸氨基转移酶( ALT ) 、天门冬氨酸氨基转移酶( AST )、碱 性磷酸酶( ALP ) ]、胆红素 [ 总胆红素( T-BIL )、直接胆红素( D-BIL )、间接胆红素( I-BIL ) ] 和胆汁酸( TBA )的水平， Western blot 法检测 HMGB1-TLR4 信号通路高迁移率族蛋白 B1 ( HMGB1 )和 Toll 样受体 4 ( TLR4 )蛋白的表达水平。结果 与正常对照组比较，模 型组肝组织损伤严重， 可见较多炎性细胞浸润以及肝细胞凋亡、坏死， 肝组织 SOD 和 GSH-PX 活力显著降低(P<0.01 )， TNF-α、IL- 1β 、 IL-6 和 MDA 水平显著升高(P<0.01 ) ，血清 T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA、ALT、AST、ALP 水平显著升高(P<0.01 ) ，肝组织 HMGB1 和 TLR4 蛋白表达水平显著上调(P<0.01 ) 。与模型组比较，黄芩甲苷组和熊去氧胆酸组均能改善肝组织损伤程度，减少炎症细胞浸润和 肝细胞凋亡、坏死， 显著升高肝组织 SOD 和 GSH-PX 活力(P<0.01 ) 以及降低 TNF-α 、IL- 1β 、IL-6 和 MDA 水平(P<0.01 ) ，显著降低血 清 T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA、ALT、AST、ALP 水平(P<0.01 ) ，下调肝组织 HMGB1 和 TLR4 蛋白表达水平(P<0.01 )。 结论 黄芪 甲苷对 DDC 诱发的小鼠胆汁淤积性肝病具有明显的保护作用，其保护作用可能与调节 HMGB1-TLR4 信号通路相关。
关键词： 黄芪甲苷; 小鼠; 胆汁淤积性肝病; 信号通路
Protective effect of astragaloside IV on DDC-induced cholestatic liver disease based on HMGB1-TLR4 signaling pathway
HU Xiao, LIU Gai*
(Second Department of General Surgery, Guangdong second people's hospital, Guangzhou, Guangdong 510317, China)
Abstract: Objective To investigate the effect of baicalin IV on mice with cholestatic liver disease. Methods Forty male SPF C57BL/6 mice were randomly divided into normal control group, model group, ursodeoxycholic acid group and astragaloside IV group. The mice model of cholestatic liver disease was established by feeding 0.1% DDC feed freely. After 5 days of modeling, the mice were given the drug by gavage for 3 days, once a day. The levels of TNF-α, IL-1β, IL-6 and MDA and the activities of SOD and GSH-PX in liver tissues were detected. The levels of liver function enzyme (ALT, AST, ALP), bilirubin (T-BIL, D-BIL, I-BIL) and bile acid (TBA) in serum were detected. The expression levels of HMGB1 and TLR4 proteins in HMGB1-TLR4 signaling pathway were analyzed by Western blot. Results Compared with the normal control group, the liver tissue in model group was severely damaged, with more inflammatory cell infiltration, apoptosis and necrosis of liver cells, the activities of SOD and GSH-PX in liver tissue were significantly decreased (P<0.01), and the levels of TNF-α, IL- 1β, IL-6 and MDA were significantly increased (P<0.01). The levels of T-BIL, D-BIL, I-BIL, TBA, ALT, AST and ALP in serum were significantly increased (P<0.01), and the protein expressions of HMGB1 and TLR4 in liver tissue were significantly up-regulated (P<0.01). Compared with model group, astragaloside IV group and ursodeoxycholic acid group could improve the degree of liver tissue injury, reduce inflammatory cell infiltration, apoptosis and necrosis of liver cells, significantly increase the activities of SOD and GSH-PX in liver tissue (P<0.01), and reduce the levels of TNF-α, IL-1β, IL-6 and MDA in liver tissue (P<0.01). The serum T-BIL, D-BIL, I-BIL, TBA, ALT, AST and ALP levels were significantly decreased (P<0.01), and the protein expressions of HMGB1 and TLR4 in liver tissue were down-regulated (P<0.01). Conclusion Astragaloside IV has a significant protective effect on DDC-induced cholestatic liver disease in mice, and its protective effect may be related to the regulation of HMGB1-TLR4 signaling pathway.
Keywords: Astragaloside IV; Mice; Cholestatic liver disease; HMGBI-TLR4 signaling pathway
胆汁淤积症是由于机体胆汁形成和分布障碍导致的胆 汁酸在肝细胞和胆管大量蓄积，临床上主要有以下三种胆 汁淤积症：①原发性硬化性胆管炎，②原发性胆汁性胆管 炎，③各型病毒性肝炎所致的胆汁淤积 [1] 。多种胆汁淤积 症均可导致胆汁淤积性肝病的发生，如不及时有效治疗， 甚至可能进展为肝纤维化、肝硬化、肝衰竭和肝肿瘤 [2] 。 近年来流行病学证据显示我国胆汁淤积性肝炎的发生率占 慢性肝病患者的 10% 以上 [3]。其病因尚不明确， 药物、毒 物、酒精、病毒、自身免疫等均与其密切相关 [4]。然而，临 床上治疗药物仍然十分匮乏，患者的预后不理想。截至目 前，熊去氧胆酸是唯一经美国食品药品监督管理局(FDA) 批准用于治疗胆汁淤积的药物，其不良反应逐渐被报道， 如 50% 患者对熊去氧胆酸不产生药效学反应， 长期服用的 患者常出现皮肤瘙痒、腹泻等不良反应 [5]。
黄芪，性味微温、甘，是膜荚黄芪和蒙古黄芪的根， 其具有利水消肿、补气升阳和固表止汗等功效 [6] 。在临床 治疗肝纤维化方面，黄芪发挥重要的作用。研究发现，从 黄芪中提取的单体以及单味药均呈现较强的抗肝纤维化活 性 [7] 。黄芪甲苷是其主要的活性成分，具有广谱的药理活 性，包括增强免疫力、抗氧化损伤、抗炎、抗衰老、抗病 毒等 [8] 。黄芪甲苷是否为黄芪主要的护肝有效成分之一， 其是否对 DSS 诱导胆汁淤积性肝病小鼠具有较好的保护 作用未见定论。近年来，高迁移族蛋白 B1-Toll 样受体 4 ( HMGB1-TLR4)信号通路在多种炎症性疾病发病过程中 的作用逐渐受到重视。已有研究证据表明HMGB1-TLR4 信 号通路在胆汁淤积性肝损伤大鼠模型中显著上调 [9]。此外， 有研究证据显示黄芪甲苷通过抑制HMGB1/TLR4 通路，降 低多种促炎因子的水平， 从而改善过敏性鼻炎的症状 [10] 。 本实验拟通过自由喂食 0. 1% 3,5- 二乙氧基羰基 - 1,4- 二 氢 - 2,4,6- 三甲基吡啶(DDC)饲料建立小鼠胆汁淤积性 肝病模型，以 HMGB1-TLR4 信号通路为切入点，初步探 讨黄芪甲苷对胆汁淤积性肝病小鼠的保护作用。
1 材料与方法
1.1 主要药物、试剂与仪器 黄芪甲苷，购于武汉克米克 生物医药技术有限公司(纯度≥99% )；熊去氧胆酸胶囊， 购于德国 Losan Pharma GmbH(批号： 15A10039L )；DDC ， 购于 Sigma 公司；肿瘤坏死因子( TNF )- α 、白细胞介素 ( IL )- 1β 和 IL-6 检测试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有 限公司；谷丙转氨酶( ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷 酸酶(ALP)、总胆红素(T-BIL)、直接胆红素(D-BIL )、 间接胆红素(I-BIL)、总胆汁酸(TBA)、超氧化物歧化酶 ( SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX ) 检测试剂盒，购于南京建成生物有限公司；HMGB1 和 TLR4单克隆抗体，购于 abcam 公司。HS-S7220 型轮转石蜡切片 机，购于沈阳恒松科技有限公司，HM-SY96A 酶标仪，购于 山东恒美电子科技有限公司；六一 DYY6D 电脑三恒电泳 仪，购于济南来宝医疗器械有限公司。
1.2 动物分组与给药 从北京华阜康生物科技股份有限 公司购买 40 只 2 月龄雄性 C57BL/6 小鼠( 18~22 g)， 其 许可证号：SCXK(京) 2019-0008。小鼠正常饮食 1 周后， 按体重随机分为正常对照组( 10 只)、模型组( 10 只)、 熊去氧胆酸组(UDCA 组，100 mg/kg，10 只)和黄芩甲苷 组(HQJG 组，40 mg/kg，10 只)。小鼠自造模 5 d 后，通 过灌胃方式给药，连续灌胃给药 3 d，其中正常对照组和 模型组小鼠以生理盐水作为对照。本实验经广东省第二人 民医院实验动物伦理委员会审批通过。
1.3 小鼠胆汁淤积性肝病模型建立 小鼠胆汁淤积性 肝病模型的构建方法 [11] 如下：小鼠自由喂养含有 0 . 1% DDC 饲料，连续喂养 5 d，构建小鼠胆汁淤积性肝病模 型，正常对照组自由喂养普通基础饲料 5 d。
1.4 肝组织病理形态学观察 取肝组织， 10% 甲醛浸泡固 定 24 h 后，切取肝组织大概 2 mm ，流水冲洗过夜，然后 分别浸泡 70% 乙醇、95% 乙醇和 100% 乙醇，各 5 h。接 着使用二甲苯透明 2 min，组织置于 60 ℃的石蜡溶液 1 h， 包埋后，待石蜡冷却凝固后切片，设定切片厚度为 4 μm。 对肝组织切片进行常规 HE 染色，使用光学显微镜观察。
1.5 肝组织匀浆炎症因子与氧化应激指标检测 取适 量肝组织并加入适量的生理盐水，使用玻璃匀浆器于冰 上研磨，最终制备 10% 肝组织匀浆，设定离心机参数： 3 500 r/min，4 ℃，离心 15 min ，随后分离上清液并保存。 对肝组织匀浆中 SOD、GSH-PX 的活力以及 TNF- α、IL-6、 IL- 1β 和 MDA 的水平进行检测。
1.6 血清胆红素、胆汁酸以及肝功能酶水平检测 麻醉 小鼠(2% 戊巴比妥钠)，通过摘眼球方式取血，将血液 置于 4 ℃冰箱中 2 h，4 ℃、3 500 r/min 离心 15 min，分装血 清，对血清 T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA、ALT、AST 和 ALP 水平进行检测。
1.7 肝组织 HMGB1 和 TLR4 蛋白表达水平检测 制备 15% 的 SDS-PAGE 电泳胶，每孔的上样量为 50 μg，SDS- PAGE 电泳分离蛋白，随后按 120 V，100 min 转 PVDF 膜， PBST 洗膜 3 次，15 min/ 次，5% 的脱脂奶粉室温于摇床中 孵育 PVDF 膜 2h，PBST 洗膜 5 次，15 min/ 次，倒入一抗 按 1 ∶2000 稀释后孵育过夜，(p-GSK-3 β)、PI3K、AKT 和 β-actin，PBST 洗膜 5 次，15 min/ 次，倒入二抗并室温摇床 中孵育 1 h，PBST 洗膜 3 次，15 min/ 次，ECL 试剂显影后， 曝光和拍照。
1.8 统计学方法 实验数据的统计学方法采用 SPSS 19.0 软件。以 (x ±s) 表示计量资料，多组间均数比较采用单因 素方差分析和 LSD 检验，P<0.05 表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肝组织病理形态学变化 正常对照组肝细胞排列整 齐、清晰(图 1-A )；模型组可见肝细胞坏死区域较大， 炎性细胞浸润较多，(图 1-B)。黄芪甲苷组和熊去氧胆酸 组肝组织上述病理学改变明显改善，见图 1-C、D。
2.2 肝组织 TNF- α、IL- 1 β 和 IL-6 水平 由图 2 可见， 模型组小鼠肝组织 IL- 1 β、IL-6 和 TNF- α 水平明显较正 常对照组高(P<0 .01 )。而黄芩甲苷组和熊去氧胆酸组 小鼠肝组织 IL- 1 β、IL-6 和 TNF- α 水平明显较模型组低 (P<0.01 )。
2.3 肝组织 SOD、GSH-PX 活力和 MDA 水平 由图 3 可 见，与正常对照组相比较，模型组小鼠肝组织 MDA 水平明显升高(P<0 .01 )，而 SOD 和 GSH-PX 活力明显降低 ( P<0.01 )。与模型组比较，黄芩甲苷组和熊去氧胆酸组 肝组织 MDA 水平明显降低(P<0.01 )，SOD 和 GSH-PX 活 力明显升高(P<0.01 )。
2.4 血清胆红素和胆汁酸水平 由图 4 结果可见，模型 组小鼠较正常对照组小鼠血清的 D-BIL、I-BIL、TBA 和 T-BIL 水平明显升高(P<0.01 )。黄芩甲苷组和熊去氧胆 酸组较模型组小鼠血清的 D-BIL、I-BIL、TBA 和 T-BIL 水 平明显降低(P<0.01 )。
2.5 各组小鼠血清肝功能酶的影响 由图 5 可见，模型组 小鼠血清肝功能酶 AST、ALP 和 ALT 水平明显比正常对照 组高(P<0.01 )。黄芪甲苷组和熊去氧胆酸组血清肝功能 酶 AST、ALP 和 ALT 水平明显比模型组低(P<0.01 )。
2.6 各组小鼠肝组织 HMGB1 和 TLR4 蛋白表达水平 与正常对照组比较，模型组肝组织的 HMGB1 和 TLR4 的 蛋白表达量明显上调(P<0.01 )。与模型组比较，黄芪甲 苷组和熊去氧胆酸组肝组织的 HMGB1 和 TLR4 的蛋白表 达量明显下调(P<0.01 )，见图 6。
3 讨论
胆汁淤积性肝病是一种由多种复杂因素所引发的胆汁 形成、分泌和排泄异常从而导致的肝病。如肝内胆汁酸的 代谢和转运出现异常，则可引发胆汁的大量淤积并入血， 从而引起血中GGT 和ALP 等的升高，严重者还可出现高胆 红素血症。由于胆汁淤积性肝病发病相对隐匿，早期症状 难发现，此外，其特异度较低的临床表现，误诊或漏诊常 有发生。胆汁在肝脏中的大量滞留是胆汁淤积性肝损伤的 主要发生机制，故降胆汁药是临床上常用的治疗药物。目 前，胆汁淤积性肝病的治疗药物主要有熊去氧胆酸和奥贝 胆酸 [12]。科研上， DDC 诱导动物胆汁淤积性肝病模型是一 种以异生素诱导的胆汁淤积新模型，其机制可能与增加胆 管上皮细胞的胆汁分泌增加有关，还可诱导骨桥蛋白、血 管细胞黏附分子和促炎因子表达，导致胆管损伤和胆汁积累， 是一种稳定性较高的胆汁淤积模型 [13]。故本研究选用 自由喂食 0. 1% DDC 饲料建立小鼠胆汁淤积性肝病模型， 以熊去氧胆酸为阳性对照药，基于 HMGB1-TLR4 信号通 路探讨黄芪甲苷对胆汁淤积性肝病小鼠的药效及机制。
炎症与氧化应激损伤参与了胆汁淤积性肝病发生发展 过程，有研究表明急性和慢性肝炎患者中，血清促炎因子 TNF-α 、IL- 1β 和 IL-6 水平明显升高，而 SOD 活力明显降 低，MDA 水平明显升高 [14- 15]。本研究发现， 黄芩甲苷可显 著降低肝组织 TNF-α 、IL- 1β 、IL-6 和 MDA 水平， 明显升 高肝组织 SOD 和 GSH-PX 活力，表明黄芩甲苷可抑制胆 汁淤积性肝炎的炎症和氧化应激损伤，阻碍疾病的发生发 展。临床上，胆汁淤积性肝炎患者血清胆红素、肝功能酶 和胆汁酸水平常有升高，故临床上常通过检测上述指标作 为评价患者肝胆功能的好坏 [16]。本研究结果表明， 黄芩甲 苷能明显降低血清 T-BIL、D-BIL、I-BIL TBA、ALT、AST 和ALP 的水平， 提示黄芩甲苷可能通过降低血清胆红素、 胆汁酸和肝功能酶水平，从而改善肝胆功能。此外，黄芩 甲苷还可减少肝细胞坏死区域，减少炎症细胞浸润，改善 胆汁淤积性肝病的症状。HMGB1-TLR4 信号通路是近年来 发现的与炎症发生发展密切相关的重要信号通路之一[17] 。 HMGB1 是机体内一种重要的促炎性细胞因子，是 TLR4 生理配体之一，与 TLR4 结合，进一步激活下游信号因子 MyD88，引起 IκBα磷酸化，促进 NF-κB 的解离，随即进 入细胞核，与系列靶基因结合，促进相关炎性因子的大量 表达， 引发机体内炎症反应过程 [18]。本研究发现， 黄芩甲 苷可明显降低肝组织 HMGB1 和 TLR4 的蛋白表达，表明 黄芩甲苷通过调节 HMGB1-TLR4 信号通路，抑制胆汁淤 积性肝病的炎症过程。
综上所述，黄芩甲苷通过抗炎、抗氧化应激损伤以及 调节 HMGB1-TLR4 信号通路对胆汁淤积性肝病小鼠具有 较好的保护作用。
参考文献
[1] SHEARN C T, FENNIMORE B, ORLICKY D J, et al. Cholestatic liver disease results increased production of reactive aldehydes and an atypical periportal hepatic antioxidant response[J]. Free Radic Biol Med, 2019, 143: 101- 114.
[2] HAN S, ZHANG T, KUSUMANCHI P, et al. Long non-coding RNAs in liver diseases: Focusing on nonalcoholic fatty liver disease, alcohol-related liver disease, and cholestatic liver disease[J]. Clin Mol Hepatol, 2020, 26(4): 705-714.
[3] 方凯璐 , 郑秀婷 , 徐丽萍 , 等 . 传统中药防治胆汁淤积性肝病的实验研究进展 [J]. 中西医结合肝病杂志 , 2020, 30(4): 375-377.
[4] YOKODA R T, RODRIGUEZ E A . Review: Pathogenesis of cholestatic liver diseases[J]. World J Hepatol, 2020, 12(8): 423-435.
[5] DONG X, LUO Y, LU S, et al. Ursodesoxycholic acid alleviates liver fibrosis via proregeneration by activation of the ID1-WNT2/HGF signaling pathway[J]. Clin Transl Med, 2021, 11(2): e296.
[6] 于淼 , 郭松霖 , 杨凯晶 , 等 . 黄芪及其制剂治疗心力衰竭的研究进展 [J]. 中医药学报 , 2021, 49(6): 94-99.
[7] 苏晓文 , 农小欣 , 王振常 , 等 . 黄芪有效活性成分对肝纤维化作用机制的研究 [J]. 河南中医 , 2021, 41(4): 618-621.
[8] 孔祥琳 , 吕琴 , 李运伦 , 等 . 黄芪甲苷对心脑血管疾病的现代药理作用研究进展 [J]. 中国实验方剂学杂志 , 2021, 27(2): 218-223.
[9] NABIH E S, EL-KHARASHI O A. Targeting HMGB1/TLR4 axis and miR-21 by rosuvastatin: role in alleviating cholestatic liver injury in a rat model of bile duct ligation[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2019, 392(1): 37-43.
[10] 田滢 , 张飞 , 段传新 . 黄芪甲苷对过敏性鼻炎小鼠HMGB1/TLR4/NF-κB 信号通路的影响 [J]. 现代免疫学 , 2021, 41(1): 50-55.
[11] ZOU J, LI W, WANG G, et al. Hepatoprotective effects of Huangqi decoction (astragali radix and glycyrrhizae radix et rhizoma) on cholestatic liver injury in mice: Involvement of alleviating intestinal microbiota dysbiosis[J]. J Ethnopharmacol, 2021, 267: 113544.
[12] 刘洪涛 , 杨玉鹏 , 任炳楠 . 胆汁淤积性肝病治疗药物的临床研究 进展 [J]. 化学试剂 , 2021, 43(1): 34-40.
[13] 杜丽娜 , 杨燕 . 胆汁淤积动物模型的构建及应用前景 [J]. 临床肝胆病杂志 , 2019, 35(2): 444-447.
[14] 邬小萍 , 易冬英 , 黄建生 . 慢性乙型重型肝炎中 TNF-α, IL1β, IL6与病毒含量关系的研究 [J]. 江西医学院学报 , 2006(1): 16- 18.
[15] 叶瑛 . 急性病毒性肝炎病人中 IL-1α 、IL-1β 、IL-6 和 TNF-α 的血清水平 [J]. 国外医学 . 流行病学传染病学分册 , 1994(5): 229-230. [16] 梅玉红 . 总胆红素、总胆汁酸、前白蛋白三项检测在肝脏疾病诊断中的价值 [J]. 当代医学 , 2016, 22(18): 98-99.
[17] ZHANG Y, ZHANG H, ZHANG Z, et al . LncRNA MALAT1 cessation antagonizes hypoxia/reoxygenation injury in hepatocytes by inhibiting apoptosis and inflammation via the HMGB1-TLR4 axis[J]. Mol Immunol, 2019, 112: 22-29.
[18] WANG Q, ZHAO H, GAO Y, et al. Uric acid inhibits HMGB1- TLR4-NF-κB signaling to alleviate oxygen-glucose deprivation/ reoxygenation injury of microglia[J] . Biochem Biophys Res Commun, 2021, 540: 22-28.
关注SCI论文创作发表，寻求SCI论文修改润色、SCI论文代发表等服务支撑，请锁定SCI论文网！
文章出自SCI论文网转载请注明出处：https://www.lunwensci.com/yixuelunwen/47171.html
