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摘要：目的对人骨髓间充质干细胞进行原代提取、细胞性质鉴定及成神经细胞分化诱导，探讨人骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的可能性，为自体细胞移植提供种子。方法使用试剂盒进行骨髓有核细胞混悬液的制备，纯化培养后对细胞进行流式细胞术鉴定，对成神经分化诱后细胞进行染色形态学观察。结果原代提取细胞培养至10天时可呈漩涡性生长，类细胞克隆样。细胞存在稳定的干性表达，70%骨髓间充质干细胞可实现成神经细胞诱导分化。结论原代人骨髓间充质干细胞可实现向成神经细胞的诱导分化。
关键词：人骨髓间充质干细胞；原代提取；神经诱导分化
本文引用格式：杨华,吴雷,孙赛男,等.人骨髓间充质干细胞原代提取及成神经诱导分化[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(101):73-74.
0引言
运动神经元病为神经系统死亡率、致残率均较高的疾病，患者在病程中可表现为脊髓前角细胞受损、脑干运动神经元缺失以及皮质锥体细胞和锥体束等单一损伤或累加症状。目前尚无有效药品能阻止运动神经元病的进展，患者多在5年内死亡，为此国内外学者将治疗方案寄希望于神经细胞移植以及神经细胞的自体修复，研究结果提示间充质干细胞可以在受损的脑组织及脊髓中生存、增殖、迁移及分化成神经样细胞。本研究旨在探讨间充质干细胞原代提取的方法及细胞诱导分化能力，为自体细胞移植奠定基础。
1资料和方法
1.1主要试剂。DMEM/F12培养液（Gibco），胎牛血清（Hyclone），抗CD14、CD19、CD45、HLA-DR及CD73、CD90、CD105单克隆抗体，碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子购自中国碧云天生物技术公司。《骨髓、脐带血细胞处理试剂盒》来源于加拿大威尔森公司。其他试剂均由北华大学附属医院脑血管病研究所提供。
1.2间充质干细胞的分离和培养。日间手术室取患者髂前上棘5 mL骨髓液注入15 mL无菌离心管培养液内。按加拿大威尔森公司研制的《骨髓、脐带血细胞处理试剂盒》说明书进行骨髓有核细胞混悬液的制备及细胞计数。所获得的细胞沉淀使用含10%胎牛血清的DMEM/F12（100 u/mL青霉素和100 u/mL链霉素）培养液重新制成单细胞悬液，接种于培养瓶中，在5%CO2，37℃，饱和湿度的培养箱中培养，培养3天后进行首次换液，弃去未贴壁细胞，后续2-3天换液1次，待细胞融合达80%以上使用0.25%胰蛋白酶进行消化并传代培养。
1.3流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞干性。取上述状态良好，细胞融合度达80%者应用0.25%胰蛋白酶进行消化，细胞离心处理后制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106个/L，分装于EP管中。100μL单细胞悬液中分别加入抗CD14、CD19、CD45、HLA-DR及CD73、CD90、CD105(各20μL)单克隆抗体反应30 min，灭菌0.1 mol/L PBS液进行细胞冲洗3次，与FITC标记的二抗避光反应30 min，操作前0.1mol/L PBS重悬细胞。
1.4骨髓间充质干细胞成神经诱导分化。取3代内状态良好，细胞融合度达80%者应用0.25%胰蛋白酶进行消化，细胞离心处理后制备单细胞悬液，细胞按1×106个/L接种于6孔板中，加入神经细胞诱导的DMEM/F12培养基(含2%B27、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L表皮生长因子)，倒置显微镜下观察细胞的形态变化。细胞趋化似神经细胞后进行细胞爬片，玻片在室温下行4%多聚甲醛固定，经碱性磷酸酶染色法，倒置显微镜下采集图像。
2结果
2.1人骨髓间充质干细胞原代提取及培养。原代提取单细胞，细胞呈现圆形或椭圆形。待细胞培养48 h以后可见部分细胞呈现贴壁现象，进行换液后继续培养。细胞培养至10天时细胞可呈漩涡性生长，类细胞克隆样（见图1）。
2.2人骨髓间充质干细胞流式细胞术干性鉴定。流式细胞仪检测显示，原代提取及培养人骨髓间充质干细胞表达CD73（98.6%）、CD90（99.8%）及CD105（95.2%），不表达CD14（0%）、CD19（0%）、CD45（0%）及HLA-DR（0.1%）（见图2）。
2.3骨髓间充质干细胞成神经诱导分化后碱性磷酸酶染色。细胞传代至第3代的间充质干细胞成神经诱导分化细胞进行碱性磷酸酶染色。倒置纤维镜下观察被诱导的神经细胞形态大部分已经贴壁，胞体形态可见呈纺锤形或扁平形，部分伸出小的突起或数量不等的棒状大突起，表现为类胶质细胞样。被成功诱导的成神经细胞达到70%以上，胞体仍为无色，小部分未被成功诱导细胞呈现为蓝紫色（见图3）。
3讨论
近年来关于间充质干细胞的研究层出不穷，学者们发现间充质干细胞可存在于多种组织中，具有较强的自我更新、多向分化的潜能[1]。在体外实验中发现，不同的诱导条件可使其向不同组织细胞分化，包括成骨、成软骨细胞及成脂肪细胞等。也有学者致力于间充质干细胞向“不再生细胞”的诱导[2],研究结果发现适当的诱导剂可实现神经细胞及心肌细胞的分化。这一研究结果为治疗损伤神经的再生提供了有力理论依据。在后续的研究中有学者将诱导的成神经细胞或原代神经干细胞移植入脑梗死[3-4]、脑出血及脊髓损伤等动物模型中，结果发现该治疗方法可促进受损伤的神经功能得到部分修复[5-6]，并且移植的神经细胞及神经干细胞均能够在特定位置分化成神经元和神经胶质样细胞[7]。目前，大量的研究取才为胚胎干细胞诱导所得或直接从发育中和成体神经组织中分离培养获得，但存在伦理及安全的局限性，很大程度限制了神经干细胞移植治疗的临床应用进程。因此，很有必要寻找其它能够获得的途径来克服这些限制。
本研究中以自体骨髓为来源，进行骨髓间充质干细胞的原代提取及培养，经流失细胞术检测确定了该种细胞可表达CD73、CD90及CD105，不表达CD14、CD19、CD45及HLA-DR，具有较高的干性保持度。在体外经培养环境诱导发现70%细胞可实现成神经细胞的有效诱导。为后续自体骨髓间充质干细胞来源诱导成神经细胞在神经系统退行性疾病中的应用提供“种子”基础。
参考文献
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[4]刘宗秀,张紫微,周晓红,等.γ-分泌酶抑制剂对脑缺血大鼠神经干细胞移植后神经保护作用[J].解剖学报，2019,2(50):145-151.
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[6]Arumugam TV，Baik SH，Balaganapathy P，et al．Notch signaling and neuronal death in stroke[J].Prog Neurobiol,2018,5:103-116.
[7]吴增,李媛,高维娟,等.神经干细胞提取与培养方法的比较研究[J].中国药理学通报,2018,34(05):729-734．
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