金山五味子须根部位内生真菌FR-1次生代谢产物研究论文

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摘要：目的对金山五味子须根部位内生真菌FR-1的的发酵液进行化学成分的分离及鉴定。方法采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱和高压液相色谱等分离手段，从乙酸乙酯萃取和甲醇部分中，通过利用EI-MS、1H-NMR、13C-NMR以及与文献对照等手段，鉴定化合物的结构。结果分离得到9个化合物分别鉴定为Palmitic acid，2-ethylhexyl 1H-imidazole-4-carboxylate，5,8-epidioxyergosta-6,9(11),22-trien-3-ol，(+)-anwulignan,epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol，(+)gomisinK3，meso-dyhydroguaiavetic acid，Schisanlactone A，(-)-chicannine结论首次发现内生真菌能产生木质素类化合物。

关键词：五味子科;金山五味子;内生真菌;化学成分

本文引用格式：毛瑞华，窦智.金山五味子须根部位内生真菌FR-1次生代谢产物研究[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(76):221-222.

Chemical Constituents of the Fermentation Broth of the Endophytic Fungi from Fibrous Roots of the Schisandra glaucescens Diels

MAO Rui-hua,DOU Zhi*

(Tongji Hospital,Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology,Wuhan Hubei)

ABSTRACT:Objective to investigate the metabolites of an endophytic fungi from fibrous roots of the Schisandra glaucescens Diels.Methods The chemicial constituents were isolated by various chromatography techniques and their structures were elucidated on the basis of spectroscopic analysis.Results 9 compounds were isolated from the ethyl acetate and methanol extract of the the fermentation broth of the endophytic fungi.Conclusion they were determined as Palmitic acid(compound 1),2-ethylhexyl 1H-imidazole-4-carboxylate(compound 2),5,8-epidioxyergosta-6,9(11),22-trien-3-ol(compound 3),(+)-anwulignan(compound 4),epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol(compound 5),(+)gomisinK3(compound 6),meso-dyhydroguaiavetic acid(compound 7),Schisanlactone A(compound 8),(-)-chicannine(compound 9),respectively.It is noteworthy to discover the production of lignans from the endophytic fungi for the first time.KEY WORDS:Schisandraceae;Schisandra glaucescens Diels;Endophyte;Chemical composition

0引言

中药金山五味子(Schisandra glaucescens Diels)隶属五味子科(Schisandraceae)五味子属(Schisandra)，落叶木质藤本，全体无毛，老枝黑褐色，小枝紫红色。主要分布产于湖北西部、四川中南部和东部。其果实味甜可食，可供药用。近代科学研究表明，五味子科植物有着良好的保肝降酶、抗肿瘤、抗病毒等药理活性，其主要活性物质是木脂素和三萜。

植物内生菌是一个多样性十分丰富的生物类群，在植物体内广泛存在，分布于植物的叶鞘、叶片、花、茎、果实和种子等器官、组织的细胞或细胞间隙中。内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中，并与宿主协同进化。近年来的研究结果表明：内生菌的次生代谢产物中可能含有与宿主植物相同或相似的活性成分。本课题旨在寻找金山五味子须根部位一种内生真菌中可能存在的具有药用价值的天然产物。

1材料与方法

1.1材料

(1)菌种：实验材料五味子须根部位内生真菌，鉴定为毛壳霉属。

(2)菌种培养：接种在液体培养中，在CO2恒温培养箱中培养30 d，分别收集菌丝体和发酵液。

1.2仪器

Quattro Micro API三重四极杆液质联用仪；Thermo LTQ-Orbitrap XL质谱仪；Bruker-AM400型核磁共振仪，TMS为内标；柱色谱硅胶(100-200目，200-300目)和薄层色谱硅胶GF254均为青岛海洋化工厂生产；Waters2545高效液相制备级色谱仪(SunFire C18制备柱，10×250 mm，5m)和Waters e 2695高效液相色谱仪(SunFire C18分析柱，2.1×150 mm，3.5m)。

1.3提取与分离

向常温发酵30 d的真菌发酵液(16 L)中加入等体积乙酸乙酯，摇床震荡提取3次，每次180 min，提取液浓缩得到乙酸乙酯部位浸膏，将萃取溶剂换为甲醇重复以上萃取步骤对菌液再次萃取3次，得到总浸膏8 g。

乙酸乙酯部位浸膏(8 g)经过硅胶柱层析，洗脱体系为石油醚-乙酸乙酯(10:1→0:1),TLC检测后合并色谱行为相似的流份。

经过半制备RP-HPLC(甲醇-水90:10)得到化合物1(2 mg),化合物2(3 mg),化合物3(5mg),化合物4,化合物5(3 mg),化合物6(1 mg),化合物7(1 mg),化合物8(1mg)和化合物9(1 mg)。

2化合物结构鉴定

化合物1白色晶体，1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ:2.28(2H，t，J=7.43)，δ1.58(2H，dt，J=10.61，21.29)，δ1.31(24H，overlapped，J=9.38)，δ0.91(3H，t，J=6.85)。数据显示其为链状脂肪族化合物，与文献[1]对比后，鉴定其为软脂酸。

化合物2白色固体，1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ:：7.51(1H，dd)，7.70(1H，dd)，4.22(2H，m，1.68(1H，m)，1.32(2 H，m)，1.35(2H，m)，1.40(2H，m)，0.89(3H，t)，1.33(2H，m，Ha)，0.92(3H，t，Hb)。经文献[2]验证，该结构的核磁图谱与本实验中所做谱图基本一致,鉴定其为2-ethylhexyl 1H-imidazole-4-carboxylate。

化合物3白色固体，1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ:4.0(1H，m)，6.28(1H，d，J=8.46)，6.59(1H，d，J=8.54)，5.42(1H，dd，J=2.0，6.0)，0.73(3H，s)，1.22(3H，s)，1.09(3H，d，J=6.7)，5.15(1H，dd，J=15.4，8.1)，5.24(1H，dd，J=15.4，7.4)，0.82(3H，d，J=3.6)，0.81(3H，d，J=6.3)，1.00(3H，d，J=6.7).13C-NMR(CDCl3，100MHz)δ：36.0(C-1)，30.6(C-2)，66.3(C-3)，38.0(C-4)，82.7(C-5)，135.1(C-6)，130.7(C-7)，78.4(C-8)，142.5(C-9)，38.0(C-10)，119.7(C-11)，41.2(C-12)，43.6(C-13)，48.1(C-14)，20.9(C-15)，29.7(C-16)，55.9(C-17)，13.0(C-18)，25.5(C-19)，39.9(C-20)，20.7(C-21)，135.5(C-22)，132.4(C-23)，42.8(C-24)，33.0(C-25)，19.9(C-26)，19.6(C-27)，17.5(C-28)。以上数据与[3]报道的基本一致，鉴定为5,8-epidioxyergosta-6,9(11),22-trien-3-ol。

化合物4黄色油状液体，1H-NMR显示了芳香区有两组ABX偶合质子，分别是δ6.82(1H，d，J=7.92Hz，H-5’)，δ6.62(1H，d，J=1.6Hz，H-2’)，δ6.62(1H，dd，J=1.6，7.72Hz，H-6’)和δ6.72(1H，d，J=7.84Hz，H-5)，δ6.65(1H，d，J=1.33Hz，H-2)，δ6.60(1H，d，J=1.4，7.91Hz，H-6)提示结构中的两个1,3,4-三取代苯环；δ5.92(2H，brs，OCH2O)，δ5.45(1H，s，OH)，δ3.86(3H，s，OMe)显示了苯环的取代基。高场区亚甲基信号δ2.29,2.73(1H，each，m，H-7’)，δ2.24,2.70(1H，each，m，H-7)；叔碳氢δ1.73(1H，m，H-8’)，δ1.72(1H，m，H-8)；与叔碳连接的甲基氢δ0.84(3H，s，H-9’)，δ0.82(3H，s，H-9)。通过与肖培根等关于合蕊五味子的文献[4]中的相关数据进行比对并结合刘嘉森[5]等的CD数据确定了绝对构型，最终鉴定化合物化合物1为(+)-anwulignan。

化合物5无色细毛状晶体，1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ:6.50(1 H,d,J=8.5 Hz),6.24(1 H,d,J=8.5 Hz),5.22(1 H,d,J=9.0Hz),5.14(1 H,d,J=9.0 Hz),3.96(1 H,m),0.99(3 H,d,J=6.7 Hz),0.90(3H,d,J=6.5 Hz),0.88(3 H,s),0.84(3 H,d,J=6.6 Hz),0.81(3 H,s)，0.80(3 H,d,J=6.7 Hz).13C-NMR(CDC l3，100 MHz)δ：36.89(C-1)，30.06(C-2)，66.40(C-3)，34.66(C-4)，82.14(C-5)，135.17(C-6)，130.70(C-7)，79.40(C-8)，51.06(C-9)36.93(C-10),20.60(C-11)，39.31(C-12)，44.53(C-13)，51.188(C-14)，23.37(C-15)，28.60(C-16)，56.17(C-17)，12.84(C-18)，18.14(C-19)，39.69(C-20)，20.85(C-21)，135.39(C-22)，132.27(C-23)，42.74(C-24)，33.03(C-25)，19.61(C-26)，19.91(C-27)，17.53(C-28)。以上数据与张晓琦等[6]报道的基本一致，鉴定为过氧化麦角甾醇(ergosterolperoxide)。

化合物6白色固体,1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ:6.58(1 H,s),2.06(1H,dd,1.55,13.11),2.29(1H,dd,9.53,13.11),1.80(1H,m),1.90(1H,m),2.58(1H,7.42,13.55),2.48(1H,1.56,13.55),6.38(1H,s),1.00(3H,d,7.14),0.76(3H,d,7.10),3.49(1H,s),3.92(3H,s),3.90(3H,s),3.89(3H,s),3.88(3H,s)。以上数据与[7]报道的基本一致，鉴定为(+)戈米辛K3((+)gomisinK3)。

化合物7白色固体，NMR谱(表4)提示其具有对称结构，1H-NMR谱显示芳香区有一组ABX偶合质子，即δ6.82(2H，each d，J=8.0Hz，H-5，H-5’)，δ6.65(2H，each dd，J=1.71,8.0Hz，H-6，H-6’)，δ6.61(2H，each d，J=1.68Hz，H-2，H-2’)；而δ5.45(2H，each s，0H)，δ3.85(6H，s，OCH3×2)；高场区有一组呈ABX偶合的亚甲基质子信号：δ2.73(2H，each dd，J=13.45，5.01Hz，H-7b，H-7’b)和δ2.28(2H，each dd，J=13.5,9.23Hz，H-7a，H-7’a)；叔碳氢δ1.74(2H，each，m，H-8，H-8’)；与叔碳的两个甲基氢δ0.84(6H，each d，J=6.65Hz，H-9，H-9’)。将化合物参数与文献[8-9]比对，最终鉴定化合物7为meso-dyhydroguaiavetic acid。

化合物8白色针状晶体，1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ:6.67(1H,d,J=12.27),5.78(1 H,d,J=12.14),2.48(1 H,dd,6.11,12.81),0.80-0.89(1H,m),1.84-1.88(1H,m),1.18-1.30(1H,m),2.32-2.37(1H,m),2.02-2.05(1H,m),2.16-2.21(1H,m),1.59-1.62(1H,m),2.16-2.21(1H,m),1.41-1.49(1H,m),2.02-2.08(1H,m),1.60-1.64(1H,m),2.02-2.08(1H,m),1.54-1.56(1H,m),0.75(3H,s),6.23(1H,s),2.02-2.07(1H,m),1.02(3H,s),4.47(1H,d,J=3.3,13.2),2.03-2.07(1H,m),2.35-2.42(1H,m),6.61(1H,d,J=6.37),1.89(3H,s),1.05(3H,s),1.54(3H,s),1.40(3H,s)将数据陈业高[10]等人的数据比对，鉴定化合物8为Schisanlactone A。

化合物9白色晶体，1H-NMR(CDCl3400MHz)δ:6.89(1H,d,J=1.15),6.78(1H,d,J=7.98),6.80(1H,dd,J=1.15,8.32),4.62(1H,d,J=9.13),2.39-2.50(1H,m),0.99(3H,d,J=6.34),6.93(1H,d,J=1.64),6.86(1H,d,J=8.08),6.84(1H,dd,J=1.67,8.16),5.42(1H,d,J=4.45),2.39-2.50(1H,m),0.62(3H,d,J=6.94),5.94(2H,brs),3.91(3H,s),5.98(1H,s)。上述数据与[11-12]的数据一致，鉴定其为(-)-chicannine。

3总结与讨论

我们对金山五味子须根部位一种毛壳霉属的内生真菌次生代谢成分进行了系统分离和研究，从约16L发酵液中分离并初步鉴定了9个化合物，包括1个为三萜(化合物8，Schisanlactone A)，4个木脂素(化合物4(-)-chicannine，化合物6(+)gomisinK3，化合物7 meso-dyhydroguaiavetic acid，化合物9(+)-anwulignan)，1个生物碱(化合物2 2-ethylhexyl)，1个脂肪族化合物(化合物1 Palmitic acid),2个甾体(化合物3 5,8-epidioxyergosta-6,9(11),22-trien-3-ol,化合物5 epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol)。这是首次发现内生真菌能产生木质素类化合物，而其宿主金山五味子作为药用的活性成分主要为木质素和三萜，这进一步验证了内生菌的次生代谢产物中可能含有与宿主植物相同或相似的活性成分，但这种活性成分是来源于宿主植物还是菌体自身，至今尚不明确。

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