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摘要：目的在突发性流行性脑膜炎疫情中，使用咽拭子样本直接进行荧光定量PCR检测来指导细菌纯培养，以达到快速检测、提高检出率的目的，分析方法、对比数据，讨论此次联用方法在处突工作中的运用效果。方法采集乌鲁木齐市流行性脑膜炎疫情密切接触人群的咽拭子标本，对咽拭子样本和平皿培养物同时进行检测，利用咽拭子PCR结果引导细菌纯培养。结果两种检测方式相辅联用，最终检出率较单一细菌培养法提高4.1%。结论联用荧光定量PCR法为细菌培养、获取目标纯菌做范围指引，效果显著，有效提高了脑膜炎奈瑟氏菌的检出率和实验室检测能力，在疫情快速处突方面值得应用。
关键词：脑膜炎奈瑟氏菌；荧光定量PCR法；细菌培养法；检出率
本文引用格式：姜亦华,谢康.PCR法指导细菌培养法在一起流行性脑膜炎疫情中的运用效果[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(71):339-340.
0引言
流行性脑膜炎又叫做流行性脑脊髓膜炎，简称流脑。是由脑膜炎双球菌引起的化脓性脑膜炎，易形成败血症，死亡率非常高，会留下严重的后遗症，并且是通过呼吸道传播引起的一种急性呼吸道传染病[1]。根据脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖抗原免疫学的特性，可将其划分为13个血清群。我国过去所发生的3次全国性大流行都是由A群的脑膜炎奈瑟氏菌引起的。虽然我国流脑的防治取得一定的成效，但是流脑仍时有爆发流行，尤其是新疆是流行性脑膜炎高发地，近五年发病率均居全国前5位[2,3]。2019年5月31日，接报告，新疆乌鲁木齐某职业技术专科学校发生一起流行性脑膜炎疫情，1个死亡病例。赶赴现场共采集密切接触人群咽拭子样品49份，未能采集到死亡患者样本。本文通过对咽拭子样本同时进行荧光定量PCR法和细菌培养法检测，分析两者实验数据，对比联用方法及单一性方法两者检测效率优劣，以期今后在同类处突工作中更准确有效得到检测结果，为控制疫情爆发及时提供参考依据。
1资料与方法
1.1标本来源
2019年5月31日，新疆乌鲁木齐某职业技术专科学校发生一起流行性脑膜炎疫情，采集密切接触人群49份样本，均为在校学生。
1.2试剂
双抗巧克力琼脂血平板（多粘菌素、万古霉素），购自郑州安图生物工程股份有限公司。DNA提取试剂盒（QIAamp 51304）、realtime PCR引物及探针（北京天一辉远生物科技有限公司）、PCR反应mix（康为世纪生物科技有限公司）。
1.3仪器设备
二氧化碳培养箱，品牌为德国Memmert，型号INC153；实时荧光定量PCR仪，品牌为西安天隆，型号TL988；离心机，品牌为德国Sigma，型号1-14。
1.4检测方法
1.4.1对纯分离培养物进行荧光定量PCR检测
咽拭子样本现场接种于预平衡温度的双抗巧克力琼脂血平板，保温送回实验室，检测人员将平板放入含5%CO2培养箱中，设定37℃，培养18~24h。之后，挑取直径在1~2mm、灰白色、湿润、半透明的单个菌落进行纯分离培养18~24小时。纯分离后挑取单个目标菌落，涂片染色后进行镜检，形态学确认后，直接对纯分离培养物进行PCR检测。方法为挑取符合要求的单个菌落，加入100ul超纯水，混匀，95-100℃金属浴，恒温10min，12000rpm，离心5min，吸取上清液，即为所需DNA模板。实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测运用real-time PCR鉴定Nm种属和基因群：应用ctrA基因鉴定Nm种属,阳性者再进行A、B、C、X、Y、W常见血清群的real-time PCR检测。总反应体系为20µl，分别是DNA模板2µl，2×mix 10µl，正、反向引物各1µl，探针（10×）1µl，ROX 0.4µl，水4.6µl。反应条件：按照TaKaRa DRR390A Mix设置反应条件：①95℃30 s1个循环。②95℃5 s，60℃34s，50个循环，终末收集荧光[6]。
1.4.2对咽拭子样本进行荧光定量PCR检测
使用无菌棉拭子采集样本，涂抹擦拭密切接触人群咽后部黏膜处分泌物进行样本采集，样本置于运输管中保温送至实验室直接进行PCR方法检测，使用煮沸法提取脑膜炎奈瑟氏菌DNA模板。方法为将咽拭子标本在600ul PBS缓冲液中进行洗脱，12 000rpm，离心5min，弃上清，在沉渣中加入60ul超纯水，95-100℃金属浴，恒温10min，12000rpm，离心5min，吸取上清液，即为所需DNA模板。实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测运用real-time PCR鉴定Nm种属和基因群：应用ctrA基因鉴定Nm种属,阳性者再进行A、B、C、X、Y、W常见血清群的real-time PCR检测。总反应体系为20µl，分别是DNA模板2µl，2×mix10µl，正、反向引物各1µl，探针（10×）1µl，ROX 0.4µl，水4.6µl。反应条件：按照TaKaRa DRR390A Mix设置反应条件：①95℃30 s 1个循环。②95℃5 s，60℃34 s，50个循环，终末收集荧光。
2结果
2.1密切接触者49份咽拭子样本进行荧光定量PCR检测结果，检出阳性样本20份，检出率40.8%；对49份纯分离培养物进行检测，检出阳性样本18份，检出率36.7%；利用咽拭子样本PCR检测结果引导细菌培养方向，共检出阳性样本22份，检出率达44.9%，详见表1。
2.2荧光定量PCR分型结果，检出B群9株、C群1株、W群12株、Y群1株；其中6号为B群兼W群样本，详见表2。
3讨论
在处理突发疫情时，实验数据的检测速度与检出率至关重要。按照以往单一细菌培养法检测脑膜炎奈瑟氏菌，检出率不理想，且血清分型时对诊断血清的质量、目标菌纯化度等条件要求较高，与实验室环境以及实验人员判断凝集的能力有着密切的关系，干扰因素较多，且患者若使用抗生素或运输中细菌死亡，可能出现漏检、假阴性的情况，无法有效分离到目标菌株,从而降低了检出率[4,5]。本次试验在细菌培养的同时，对咽拭子样本进行荧光定量PCR检测，为细菌培养、纯化起到很好的引导、划定可能范围的作用，避免出现漏检、假阴性的问题。试验中，2、13、17、26号4份样本，在咽拭子样本PCR检测中呈阳性结果，但在第一次细菌培养中却未分离到目标菌，通过比对咽拭子PCR结果，进行第二次纯分离培养，并顺利获得目标纯菌，检出率提高约4%；7号样本与9号样本在咽拭子PCR检测中未能检出阳性，在细菌培养中则检出阳性，分析问题可能存在于咽拭子样本的洗脱不充分所造成。两种检测方式相辅联用，最终检出率较单一细菌培养法提高4.1%，为44.9%。此次疫情49名密切接触者后期均未发病，一是及时预防性服药，二是49份样本均以B、W群2种型别为主。最近的研究结果显示，中国流脑病例流行菌群构成正在向多元化发展，A、C群流脑病例构成呈减少趋势，B、W135群、其他群及不可分群病例构成在增加[7]。新疆健康人群中Nm携带率较高，以A群病例为主，而在健康人群中未检出A群携带，以B、W群为主，新疆存在菌群变迁的风险较大[8]。试验中不足之处，因为客观原因没能采集到死亡病例样本，故未做PFGE分子分型的同源性技术分析。
综上所述，荧光定量PCR技术非常成熟，相较细菌培养法干扰因素少，检测用时短，分型快速，优势明显。联用荧光定量PCR法为细菌培养，获取目标纯菌做范围指引，效果显著，有效提高了脑膜炎奈瑟氏菌的检出率和实验室检测能力，在疫情快速处突方面值得应用。
参考文献
[1]郭琍,黄志峰,任结梅.广东省近两年流行性脑膜炎奈瑟氏菌菌群分布及药敏性结果分析[J].今日药学,2011,021(012):764-765.
[2]贺电,王雅梅,曾照丽,等.分子生物学技术用于流脑疑似病例的流行病学研究[J].中国卫生检验杂志,2007,017(010):1775-1777.
[3]王新旗,陈涛,谢娜,等.新疆奇台县某中学一起流行性脑脊髓膜炎疫情调查[J].疾病预防控制通报,2014,000(002):76-77.
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[5]孙茹.联用普通PCR法与细菌培养法检测脑膜炎奈瑟氏菌的临床意义[J].当代医药论丛,2016,014(023):99-100.
[6]陈涛,谢娜,符文慧,等.基于实时荧光定量PCR技术检测阿克苏市健康人群脑膜炎奈瑟菌携带状况[J].疾病监测,2018,033(001):59-62.
[7]李军宏,李艺星,吴丹,等.中国2006~2014年流行性脑脊髓膜炎病例菌群分布特征及变迁趋势[J].中国疫苗和免疫,2015,021(005):481-485.
[8]谢娜,陈兆云,陈涛,等.荧光PCR技术在健康人群咽部带菌调查中的应用[J].疾病监测,2018,033(008):627-631.
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