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摘要：目的建立测定伤科接骨片中4种皂苷的液相色谱方法。方法采用Diamonsil C18（250×4.6 mm 5µm）色谱柱，乙腈-水梯度洗脱，柱温30，流速1.0 mL·min-1。结果三七皂苷R1在0.50~5.04µg（R2=0.999 9），人参皂苷Rg1在1.94~19.38µg（R2=0.999 9），人参皂苷Re在0.45~4.51µg（R2=1），人参皂苷Rb1在1.88~18.84µg（R2=0.999 9）范围线性关系良好，加样回收率（n=9）分别为100.9%（RSD=1.5%），98.7%（RSD=1.7%），97.3%（RSD=1.8%），98.5%（RSD=1.5%）。结论该方法准确可靠，适用于测定伤科接骨片中四种皂苷的含量。
关键词：伤科接骨片；三七皂苷R1；人参皂苷Rg1；人参皂苷Re；人参皂苷Rb1；液相色谱
本文引用格式：薛恒跃,秦峥,邹亮.高效液相色谱法测定伤科接骨片中的四种皂苷[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(63):326-329.
Determination of Four Saponins in Shangke Jiegu Tablets by HPLC
XUE Heng-yue,QIN Zheng,ZOU Liang
(Dalian Institute For Drug Control,Dalian Liaoning)
ABSTRACT:Objective To establish an high performance liquid chromatography(HPLC)method for determining four saponins in Shangke Jiegu tablets.Methods Chromatography was performed on a Diamonsil C18 column(250×4.6 mm 5µm)at 30Ⅱ.The gradient elution was acetonitrile-water at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was at 203nm.Results The linear ranges for notoginsenoside R1,ginsenoside Rg1,ginsenoside Re and ginsenoside Rb1 were0.50~5.04µg(R2=0.9999),1.94~19.38µg(R2=0.9999),0.45~4.51µg(R2=1),1.88~18.84µg(R2=0.9999),respectively.The average recoveries were 100.9%for notoginsenoside R1(RSD=1.5%),98.7%for ginsenoside Rg1(RSD=1.7%),97.3%for ginsenoside Re(RSD=1.8%),98.5%for ginsenoside Rb1(RSD=1.5%),respectively(n=9).Conclusion The method is accurate,reliable,and suitable for determination of four saponins in Shangke Jiegu tablets.
KEY WORDS:Shangke Jiegu tablets;Notoginsenoside R1;Ginsenoside Rg1;Ginsenoside Re;Ginsenoside Rb1;HPLC
0引言
伤科接骨片由三七、红花等十二味中药材组成，现收载于《中国药典》2015年版一部，具有活血化瘀、消肿止痛、舒筋壮骨的功效。可用于治疗跌打损伤，闪腰岔气，筋伤骨折，瘀血肿痛等症[1]。三七作为方中主药之一，主要化学成分为皂苷类。以往对伤科接骨片的皂苷类成分进行测定，仅对三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1进行控制[2]，未能实现人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的分离，且现行标准中尚没有三七的含量测定项。本实验以4种皂苷类成分为指标，采用高效液相色谱建立了的含量测定方法，准确可靠，能有效控制伤科接骨片中的三七质量。
1仪器与试药
1.1仪器
Waters e2695液相色谱仪（2489紫外检测器）；Sartouris BP211D电子分析天平；SK8200LH超声波清洗器（上海科导公司）。
1.2试剂与试药
三七皂苷R1对照品（批号：110745-201318）、人参皂苷Rg1对照品（批号：110703-201529）、人参皂苷Re对照品（批号：110754-201525）、人参皂苷Rbl对照品（批号：110704-201424），均由中国食品药品检定研究院提供。乙腈为色谱纯（J.T.Baker公司），其余试剂为分析纯，水为超纯水。实验用样品，伤科接骨片，共三十个批次。
2方法与结果
2.1色谱条件及系统适应性试验
色谱柱：Diamonsil C18，5µm，250×4.6 mm；流动相：乙腈-水，梯度洗脱，见表1；柱温：30℃；检测波长：203 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20µL；理论板数按三七皂苷R1峰计算应不低于4000。
2.2对照品溶液的制备
分别精密称取三七皂苷R1对照品12.59 mg，人参皂苷Rg1对照品49.60 mg，人参皂苷Re对照品12.69 mg，人参皂苷Rb1对照品50.86 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取4 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL依次含0.101mg、0.388 mg、0.090 mg和0.377mg的混合对照品溶液。
2.3供试品溶液的制备
取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率500W，频率40kHz）45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4阴性对照液的制备
按处方比例，取除三七外的其他药材，按生产工艺制备，得阴性样品，并依“2.3”方法制成阴性对照溶液，见图1。
2.5线性关系考察
分别精密吸取上述对照品储备液2、4、8、10、15、20µl进行色谱测定，按上述色谱条件测定峰面积，以对照品进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，计算回归方程，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的回归方程分别为：Y=277424X-10199、Y=307139X-55757、Y=331047X-18604和Y=259872X-29143。三七皂苷R1在0.50~5.04µg（R2=0.999 9），人参皂苷Rg1在1.94~19.38µg（R2=0.999 9），人参皂苷Re在0.45~4.51µ（g R2=1），人参皂苷Rb1在1.88~18.84µg（R2=0.999 9）范围内线性关系良好。
2.6稳定性试验
取同一批供试品溶液，分别于0、2、4、8、24h进样测定。测得三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1峰面积RSD值分别为0.6%、0.7%、1.5%、1.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.7精密度试验
取同一批供试品溶液，重复进样6次，测得三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1峰面积RSD分别为0.5%、0.3%、1.5%、0.6%，表明仪器精密度良好。
2.8重复性试验
取同一批供试品（批号：0705）9份，按供试品溶液制备方法制备，依上述色谱条件测定并计算含量，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1平均含量分别为每片0.46 mg，2.14 mg，0.23 mg和1.81 mg，RSD分别为1.2%，1.3%，1.8%和2.0%。
2.9加样回收率试验
分别精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1对照品12.75 mg、45.78 mg、5.01 mg、36.72 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。分别精密吸取该溶液5、10、15 mL各三份，分别置具塞锥形瓶中，挥干溶剂，取已知含量的供试品（批号：0705）9份，每份约0.75g，分别加入上述具塞锥形瓶中，按供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件测定，计算回收率，见表2。
2.10样品含量测定
取30批样品，按供试品溶液制备方法制备，依上述色谱条件测定每片含量，结果见表3。
3讨论
3.1本法分离人参皂苷Rg1和人参皂苷Re，对四种指标成分进行含量控制，不仅是为多出一个指标成分，而是通过三七中人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量高，三七皂苷R1和人参皂苷Re含量少的特性，在控制含量的同时杜绝了伪品投料的发生。
3.2本方法同时测定四种指标成分，考察过如加甲醇超声、加甲醇回流、加正丁醇超声、回流及正丁醇萃取再加氨试液洗涤等多种制备方法，提取效率无显著性差异，其中以加甲醇超声法最为方便，稳定，因此选用加甲醇超声法。
3.3根据含量测定结果，根据《中国药典》2015年版一部中三七含量测定项的限度及伤科接骨片中三七药材的投料量[1]计算，总皂苷的理论含量每片应不低于4.0mg，结合含量测定结果，表明三七药材的投料量控制准确，制剂工艺、质量稳定。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京:中国医药科技出版社,2015:11,845.
[2]黄德忠.HPLC法测定伤科接骨片中的3种成分[J].海峡药学,2010,22(12),:84-85.
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