摘要：研究旨在鉴定新疆某规模化安格斯肉牛牧场中母牛乳房炎的主要病原菌，并评估其耐药性，为该牧场制定有效的乳房炎防控措施提供科学依据。无菌采集患病牛乳汁样本，通过常规微生物学方法和分子生物学技术对病原菌进行分离鉴定，并开展药敏试验以评估其耐药性。鉴定结果显示，21份乳房炎样本中有19份检出大肠杆菌。药敏试验表明，19株大肠杆菌对链霉素的耐药率最高，达到42.10%，对青霉素和氨苄西林的耐药率为36.84%。对四环素的敏感性为73.68%，而对头孢噻肟和万古霉素的敏感性最高，为84.21%。此外，多数菌株呈现多重耐药性。本研究明确了该牧场乳房炎的主要病原菌为大肠杆菌，提出科学合理的防控措施，为该牧场的防治及健康养殖提供参考依据。
关键词：安格斯肉牛,乳房炎,大肠杆菌,分离鉴定,耐药性
0引言
牛乳房炎是全球肉牛养殖业面临的主要疾病之一，尽管肉牛不作为提供乳制品的主要来源，但其一旦导致乳房炎，不仅对自身以及犊牛造成损害，还会导致巨大的经济损失[1]。近年，安格斯牛作为重要的肉牛品种，在我国的养殖规模持续扩大，但其对大肠杆菌性乳房炎的易感性较高，相关研究却相对不足。因此，深入研究安格斯母牛大肠杆菌性乳房炎的诊断与防治措施，对促进安格斯牛养殖业的可持续发展具有重要意义。
针对大肠杆菌感染引起的肉牛乳房炎，临床上多采用抗生素治疗，但长期或不规范使用抗生素易导致病原菌产生耐药性，从而降低治疗效果甚至使其失效[2]。因此，加强饲养管理和改善环境卫生被认为是预防大肠杆菌性乳房炎的有效手段之一[3-4]。
本研究从石河子地区某规模化牧场采集安格斯母牛乳房炎乳汁样本，进行病原菌分离鉴定及药敏试验。结合牧场实际情况，提出科学合理的防控措施，为该牧场哺乳期乳房炎的防治及健康养殖提供参考依据。
1材料与方法
1.1病料来源
本研究于2023年12月对新疆某规模化牧场临床诊断为乳房炎的泌乳安格斯牛进行乳样采集。根据牛场现场检查筛选出21头患病牛。采样前，采用碘伏对牛乳头及周围区域进行消毒，弃去前3把乳汁后，使用无菌采样管采集乳汁，每份样品量约10 mL，严格遵循无菌操作规范，采集时记录患牛个体编号。采集后样品立即标记并置于4℃冷藏，24 h内转运至石河子大学动物科技学院动物传染病实验室进行后续细菌分离及药敏试验。
1.2试验仪器设备
恒温培养箱（北京市永光明医疗仪器厂）、PCR扩增仪（Techne公司）、光学显微镜（Olympus公司）、电泳仪（北京市六一仪器厂）、凝胶成像系统（Biorad公司）。
1.3主要试剂
LB肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）、革兰氏染色液（珠海贝索生物技术有限公司）、2×Rapid Taq Master mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）、DNA MakerⅠ（北京全式金生物技术有限公司）、SuperRde核酸染液（合肥兰杰柯科技有限公司）。
1.4病原菌分离纯化
取病料样品无菌接种于2 mL LB液体培养基中，置于37℃摇床中过夜培养。从菌液中无菌划线接种于伊红美蓝琼脂培养基中，置于37℃温箱中培养24～48 h。挑取伊红美蓝琼脂培养基中典型单菌落接种于LB液体培养基中，37℃摇床中过夜培养；然后，划线接种于麦康凯琼脂培养基中，37℃培养24～48 h。继续挑取典型单菌落接种于LB液体培养基，37℃摇床中过夜培养，后染色镜检。
1.5 PCR鉴定设计大肠杆菌特异性引物
以疑似菌株为模板，以表1的引物序列进行PCR扩增，反应体系为25μL：2×Rapid Taq Master mix12.5μL，双蒸水8.5μL，上下游引物各1μL，细菌DNA模板2μL。根据表2进行PCR扩增。
扩增PCR产物使用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件：1×TAE电泳液，120 V，90 mA，30 min。用凝胶成像仪对电泳结果进行分析。
1.6药敏试验
挑取单菌落无菌接种于2 mL LB液体培养基中，置于37℃摇床中培养8～12 h，使用K-B法[5]进行药敏试验，取100μL均匀涂布在LB固体培养基中，用无菌镊子夹取药敏纸片贴在培养基表面，37℃静置培养16 h。药敏纸片青霉素、氨苄西林、四环素、头孢噻肟、万古霉素、链霉素。测量抑菌环直径，根据CLSI药敏试验标准[6]判定其对不同药物的敏感程度。
2结果与分析
2.1分离菌株的形态学、菌落形态鉴定结果
将菌液接种于伊红美蓝琼脂培养基上，培养基上生长出紫黑色并带有绿色金属光泽菌落（图1a）。挑取典型单菌落增菌接种于麦康凯琼脂平板中培养，发现麦康凯培养基平板上长出圆形、金属红色光泽菌落（图1b）。菌落分离纯化后，镜检结果显示该菌为革兰氏阴性杆菌，其形态与大肠杆菌一致（图1c）。
2.2分子生物学PCR鉴定结果
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，产物大小为194 bp，与预期大小一致。见图2。
2.3药敏试验结果
药敏试验表明，19株大肠杆菌对链霉素的耐药率最高，达到42.10%（8/19），对青霉素和氨苄西林的耐药率为36.84%（7/19），且多数敏感菌株表现为中低度敏感。对四环素的敏感性为73.68%（14/19），而对头孢噻肟和万古霉素的敏感性最高，为84.21%（16/19）。此外，多数菌株呈现多重耐药性。
3讨论
中国自20世纪70年代开始引进安格斯牛，目前在国内多个省份均有饲养，主要用于杂交改良和纯种繁育。
该研究通过对牧场中21份安格斯母牛乳房炎乳汁病料的分离鉴定，发现其中19份样品中均分离到大肠杆菌，这表明大肠杆菌是该牧场母牛乳房炎的主要病原菌。大肠杆菌作为一种牛乳房炎常见的条件致病菌，广泛存在于牛舍环境、饲料和饮水中，尤其在卫生条件较差的牧场中，其感染风险显著增加。大肠杆菌性乳房炎多表现为急性或亚急性症状，严重时可导致乳腺组织损伤，甚至全身性感染[7]，对肉牛健康和牧场经济效益造成严重影响。
药敏试验结果显示，分离到的19株大肠杆菌对多种抗生素表现出不同程度的耐药性。19株大肠杆菌对链霉素的耐药率最高，达到42.10%（8/19），对青霉素和氨苄西林的耐药率为36.84%（7/19）。这表明该牧场中大肠杆菌对传统抗生素的耐药性较为普遍，可能与牧场长期使用这些抗生素进行治疗或预防有关。抗生素的滥用或不合理使用是导致细菌耐药性增加的主要原因之一[8]。分离菌对四环素的敏感性为73.68%（14/19），而对头孢噻肟和万古霉素的敏感性最高，为84.21%（16/19）。这表明头孢噻肟和万古霉素可能是治疗该牧场大肠杆菌性乳房炎的有效药物。
针对本研究的发现，提出以下防控措施建议。
（1）加强环境卫生管理：定期清理牛舍，保持牛舍干燥、通风，减少环境中大肠杆菌的滋生。
（2）合理使用抗生素：应减少抗生素的预防性使用，并根据药敏试验结果，选择敏感性较高的抗生素进行治疗，避免盲目使用广谱抗生素。
（3）加强免疫管理：通过疫苗接种或营养调控提高母牛的免疫力，减少乳房炎的发生。可以接种针对大肠杆菌的疫苗，或通过添加益生菌改善肠道微生态，间接提高机体抗病能力。
（4）开展定期监测：定期对牧场中的病原菌进行分离鉴定和药敏试验，及时掌握病原菌的流行趋势和耐药性变化，为临床治疗提供科学依据。
（5）产后保健和消毒：针对不同体质产后母牛做好保健与消毒工作。
4结论
本研究通过对石河子某规模化安格斯肉牛牧场母牛乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验，明确了该牧场乳房炎的主要病原菌为大肠杆菌，并揭示了其耐药性特征。研究结果对该牧场乳房炎的防控具有重要的参考价值。未来应进一步加强牧场环境卫生管理、合理使用抗生素，并开展定期监测，产后保健，产房消毒以降低乳房炎的发生率和耐药性风险
参考文献
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[8]武瑞兵，高玉敏，王鹏翔，等．牛肉源大肠杆菌的耐药性检测及相关耐药基因分布[J]．中国畜牧兽医，2015，42（2）：452-458.
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