摘要：黄原胶作为一种生物多糖，已被广泛应用于食品和化工行业中。然而，使用野油菜黄单胞菌，通过玉米淀粉、大豆粉直接发酵得到的发酵液中往往含有大量杂质。为解决这一问题，文章通过EDTA-2Na和双酶法去除了大部分杂质，并用醇法析出了黄原胶，在50℃下真空干燥，最终得到了高透光度、高黏度的黄原胶产品。
关键词：黄原胶,双酶法,高透明度,工艺优化
黄原胶（Xanthan gum，XG）是利用野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris），以玉米淀粉、大豆粉等为原料，通过好氧发酵制取的胞外酸性多糖[1]。
本文以诱导变异的野油菜黄单胞菌为发酵菌株，利用玉米淀粉、大豆粉发酵制取黄原胶。为具备高透光、高黏度特性的黄原胶工业化生产提供了一定的理论基础和技术参考。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1材料和试剂
玉米淀粉，公司内部玉米分解制取；蔗糖，齐齐哈尔龙江阜丰生物科技有限公司；牛肉膏，北京鸿润宝顺科技有限公司；蛋白胨，北京鸿润宝顺科技有限公司；大豆粉，阜丰营销有限公司；NaCl，国药集团化学试剂有限公司；K2HPO4，宝鸡丰汇化工科技有限公司；MgSO4，乌*木齐鑫汇鑫化工有限责任公司；溶菌酶，南宁庞博生物工程有限公司生产的工业级酶制剂；碱性蛋白酶，南宁山万生物科技有限公司；乙醇，公司内部蒸馏工艺生成的食品级乙醇。
1.1.2培养基
活化培养基（g/L）：蔗糖5，牛肉膏3，蛋白胨10；pH 6.5~6.8。
一级种子培养基（g/L）：蔗糖5，牛肉膏3，蛋白胨10，K2HPO4 3；pH 7.2~7.4。
二级种子培养基（g/L）：玉米淀粉10，蔗糖5，酵母膏3，蛋白胨10，K2HPO4 3；pH 7.2~7.4。
发酵培养基（g/L）：玉米淀粉10，蔗糖5，大豆粉4.3，K2HPO4 3，MgSO4 0.5，NaCl 0.2；pH 7.2~7.4。
1.1.3主要仪器和设备
一级种子罐，20 m3江苏岭南发酵设备有限公司；二级种子罐，60 m3江苏岭南发酵设备有限公司；发酵罐，220 m3江苏岭南发酵设备有限公司；立式灭菌锅，上海申安医疗机械厂；梅特勒电子天平，梅特勒-托利多上海有限公司；NDJ-1型旋转式黏度计，上海越平科学仪器有限公司；pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；722S可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；生物分析传感仪，山东省科学院生物研究所；电热真空干燥箱，北京永光明医疗器械厂；1 500 L沸腾干燥系统，江苏先锋干燥。
1.2方法
1.2.1菌株活化
在250 mL锥形瓶中加入100 mL活化培养基，接种斜面菌株；在29℃条件下以100 r/min的速度摇床培养，振荡幅度为20 mm，培养16~18 h，OD600值为30最佳。
1.2.2种子培养
一级种子罐装入一级种子培养基装液量为50%，接入15%的菌液，温度29℃,罐压0.03 MPa，风量0.3 m3/h，初始转速为60 r/min，3 h后升至65 r/min。每隔8 h测定OD600；若OD600≥30，则进行二级种子罐扩大培养。
二级种子罐装入二级种子培养基装液量为50%，接入20%的菌液，温度为29~31℃,罐压0.05 MPa，风量为40 m3/h，通风比0.8，初始转速70 r/min。每隔8 h测定OD600；若OD600≥30，则开始准备接种。
1.2.3发酵
在220 m3的发酵罐中加入发酵培养基，将装液量60%、接种量20%、温度29~31℃、罐压0.05 MPa、pH 7作为初始条件，每6 h补一次料，24 h后结束补料。通风开始时风量为300 m3/h，8 h后升至400 m3/h，15 h后升为600 m3/h，18 h后升至800 m3/h。若发酵液黏度增加2 800 cp，则风量增加至850m3/h；黏度达到3 000 cp时，风量增加至900 m3/h，初始转速为200 r/min，8 h后转速提高到250 r/min，12 h后转速提高到280 r/min，30h后转速提高到300 r/min，36 h后停止。
1.2.4发酵液预处理
黄原胶在水溶液条件下，在-4~93℃的温度下，即使反复加热，其黏度也不会受到显著影响[2]。发酵结束后，待发酵液中残糖低于0.05%时开始消罐，升温至80℃杀死大部分菌体。为尽量减少对黄原胶结构的破坏，本文采用温和的生物酶降解法。在酶解前需去除对酶活性有干扰的金属阳离子。待温度下降到45℃时，加入EDTA-2Na持续搅拌反应4 h，去除大部分的金属阳离子。
1.2.5酶解
预处理结束后，首先加入0.3%溶菌酶酶解2 h，然后加入0.5%的碱性蛋白酶持续搅拌酶解4 h，每隔1 h送样测透光；当黄原胶透光度≥85%时，停止酶解，并将酶解后的发酵液转入提取罐。
1.2.6提取
用10%的NaOH将溶液pH调至10以上，当黄原胶析出后，由于黄原胶不溶于醇，可用40%~60%乙醇冲洗；待固液分离后，得到黄原胶沉淀和另一部分含有部分黄原胶和其余杂质的母液。将母液再次分离后回收的部分黄原胶和低质量浓度醇析后得到的黄原胶沉淀放入二次提取罐中，向罐中加入水将黄原胶重新溶解，得到高质量浓度的黄原胶溶液，再加入70%乙醇析出凝胶状态的黄原胶。
1.2.7精制工艺
黄原胶天然构象的改变会直接影响黄原胶的黏度和透光度。为保证黄原胶的透光度，需要在合适温度下进行干燥，将凝胶状态的黄原胶加入1 500 L沸腾干燥系统中，干燥后制得黄原胶产品。
1.3检测方法
1.3.1黄原胶黏度测定
黄原胶黏度通过旋转式黏度计来测定。将1%的黄原胶溶于1%的KCl溶液中，室温下使用05号转子，60 r/min条件下测定。
1.3.2黄原胶透光度测定
精确称量1.0 g样品，移入1 000 mL容量瓶中，3 000 r/min离心30 min左右至无气泡，在波长600 nm处测定其透光度。
1.3.3溶菌酶相对酶活的计算
1.3.4蛋白酶相对酶活的计算
参考GB/T 23527—2009进行蛋白酶活性检测（福林法）。
1.3.5数据处理
实验重复3次，根据测定得到的平均数与相对标准偏差，采用Origin 8.0软件进行数据分析。
2结果与讨论
2.1不同温度、pH对溶菌酶相对酶活的影响
不同pH、温度对溶菌酶相对酶活的影响如图1所示。
由图1a可知，相对酶活在pH为7时达到最高，为83.2%。在发酵液pH为7的前提下，在40、45、50、55、60、65℃温度条件下加入0.3%溶菌酶，由图1 b可知，相对酶活在50℃时达到最高，为90.1%。
2.2不同温度、pH对碱性蛋白酶酶活的影响
不同pH、温度对碱性蛋白酶相对酶活的影响如图2所示。
在发酵液温度为50℃的前提下，分别在pH为8、8.5、9、9.5、10、10.5、11的条件下加入0.5%碱性蛋白酶。由图2a可知，相对酶活在pH为10.5时达到最高，为92%。但在应用过程中发现，黄原胶在pH为8.7左右时就开始出现部分沉淀。为避免黄原胶出现品质不一的情况，需要避免在酶解过程中出现黄原胶沉淀。因此，选择pH 8作为前提，在45、50、55、60、65、70℃温度条件下加入0.5%碱性蛋白酶进行测定。由图2b可知，相对酶活在55℃时达到最高，为85%。
2.3碱性蛋白酶酶解时间对黄原胶透光度和黏度的影响
碱性蛋白酶酶解时间对黄原胶透光度和黏度的影响如图3所示。
在温度55℃、pH 8条件下，加入0.7%碱性蛋白酶，发现黄原胶黏度在酶解过程中持续下降，但下降幅度仅为2.6%。在0~4.5 h内，黄原胶透光度显著上升，4.5 h后透光度的增长幅度逐渐减缓，6 h时透光度达到90.21%，之后透光度趋于停滞，6 h后酶解反应基本结束，7.5 h时透光度达到92.06%，后出现下降。由此确定，碱性蛋白酶宜酶解4 h后，在30 min内检测黄原胶透光度，并当其≥88%时开始提取。
2.4烘干温度对黄原胶黏度和透光度的影响
烘干温度对黄原胶黏度和透光度的影响如图4所示。
研究发现，在45~60℃条件下，烘干黄原胶透光度变化不显著；当温度高于60℃时，黄原胶的透光度开始快速下降。在干燥过程中，当温度高于50℃后，黄原胶黏度出现快速下降。因此，为保证稳定制取品质较高的黄原胶，选择在50℃条件下进行烘干。
2.5试制黄原胶产品
试制黄原胶产品如图5所示。
如图5所示，左图是一般的食品级黄原胶；右图则是通过优化工艺制取的透明型黄原胶产品。透明型的黄原胶色泽更白，对产品本身的色泽影响也更低。
3结论
本文利用诱导后的野油菜黄单胞菌发酵生产黄原胶。在50℃、pH 7的条件下加入0.3%溶菌酶，反应4 h；后升温至55℃,pH调至8，加入0.5%碱性蛋白酶，反应5 h，每30 min检测1次，待透明度≥88%后进入下一步。用醇法析出黄原胶，在50℃下真空干燥，可制得黏度≥1 450 cp、透明度≥85%的黄原胶。将通过该方法制取的透明型黄原胶用于食品工业行业，既可改变食品风味、增加黏稠度，又不会影响产品色泽。但遗憾的是，该方法仍未能解决工业应用中使用大量碱和醇造成的回收成本增加和处理困难，及生物酶法导致的高成本问题。
参考文献
［1］ROSALAM S,ENGLAND R.Review of xanthan gum production from unmodified starches by Xanthomonas comprestris sp［J］.Enzyme&Microbial Technology,2006,39(2):197-207.
［2］王子朝,吴剑荣,杨利博,等.一种低黏度、高透明型黄原胶膳食纤维的功能和理化特性［J］.河南工业大学学报(自然科学版),2018,39(5):63-68.
［3］陈姗姗.基因重组溶菌酶的制备及其酶学性质的研究［D］.山东:烟台大学,2020.
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