磁性 Fe3O4@SiO2 微球的制备及尿液 DNA 的提取应用论文

　　摘要：文章采用溶剂热法制得Fe3O4纳米颗粒，并使用二水合柠檬酸钠对其进行表面改性，同时利用Stober水解法在其表面生成SiO2包覆层，得到粒径均一的超顺磁性Fe3O4 SiO2颗粒，并将其应用于尿液DNA提取。实验采用场发射扫描电镜（SEM）、红外光谱仪（FT-IR）、振动磁强计（VSM）和电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）对微球进行表征处理，并用超微量分光光度计测定核酸量和纯度。结果表明，Fe3O4 SiO2粒径均匀，表面包覆良好，且耐腐蚀性极好；提取尿液DNA，测得A 260/A 280达1.87，其纯度可满足后续的PCR要求。与共沉淀法得到的磁珠相比，溶剂热法具有磁珠用量少、不易沉降、提取率高以及DNA提取纯度高等优点。

 

　　关键词：磁性微球,溶剂热,硅包覆,尿液,DNA提取

 

　　超顺磁性的纳米磁性材料具有悬浮性好、表面积大、易分散、吸附能力强等优点，在磁记录、磁流体、生物医学、吸附材料等领域具有广泛的应用前景[1-2]。其中，超顺磁性的Fe3O4纳米颗粒尤受关注，但未经表面修饰的Fe3O4纳米颗粒亲水性差、易团聚，表面缺少活性基团，无法满足生物医学的应用要求。因此，需要用特定材料包覆形成特定功能的核壳结构。其中，SiO2包覆材料具有无毒无害、亲水性好、耐酸碱、表面富含硅羟基、生物相容性良好，以及易于实现表面功能化等优点，可充当Fe3O4纳米颗粒的表面包覆材料[3-5]。

 

　　在Fe3O4 SiO2包覆过程中，易发生Fe3O4纳米颗粒团聚以及SiO2单独成核的现象。因此，本研究通过在包覆前对纳米Fe3O4粒子进行表面修饰来减少该类现象。研究先采用溶剂热法[6]制得Fe3O4纳米颗粒，再由二水合柠檬酸钠对其进行表面改性，最后利用Stober水解法[7]在其表面生成一层无定型SiO2包覆层，从而得到磁性Fe3O4 SiO2纳米颗粒[7]。

 

　　尿液中的DNA主要来自尿道中脱落的细胞。用尿液DNA进行分子生物学基础研究和临床诊断具有以下优点：1）尿液收集属于非介入、无创伤性活动；2）从尿液中提取DNA要比从血液中提取DNA更简单。提取的DNA可用于尿路肿瘤检查、PCR分析、DNA甲基化检测、微生物检测等[8-10]。本研究中，采用溶剂热法合成的磁性Fe3O4 SiO2纳米颗粒粒径均匀、饱和磁化强度高、表面羟基数量多，特别适用于尿液DNA提取。与共沉淀法合成的磁珠相比，溶剂热法具有磁珠用量少、不易沉降、提取率高，以及DNA提取纯度高等优点。

 

 

　　1.1试剂与原料

 

　　乙二醇；无水乙酸钠；FeCl3·6H2O；无水乙醇；二水合柠檬酸钠；正硅酸乙酯；氨水。以上试剂均为分析纯。尿液为同事提供；尿液DNA提取试剂盒由广州康立明生物科技股份有限公司提供。

 

　　1.2 Fe3O4 SiO2纳米颗粒的合成

 

　　量取140 mL乙二醇，加入25 mmol的FeCl3·6H2O，超声混匀，加入65 mmol无水乙酸钠，超声混匀后置于水热反应釜中，200℃反应8 h，冷却至室温后，将产物用磁铁收集至烧杯中，用无水乙醇洗涤3次。将室温下干燥得到的Fe3O4纳米颗粒溶解到100 mL纯水中，加入一定量的二水合柠檬酸钠，超声混匀，通入氮气并接通冷凝水，60℃水浴搅拌7 h，取出并用纯水洗涤3次。将经过修饰的Fe3O4纳米颗粒加入100 mL纯水中，超声混匀，通入氮气并接通冷凝水，50℃水浴搅拌，再加入4 mL氨水，达到一定温度后使用恒压滴液漏斗滴加一定量的正硅酸乙酯混合液，滴加速度为3~6 s/滴，反应12 h后取出，用无水乙醇洗涤3次，最后于室温下干燥，得到磁性Fe3O4 SiO2纳米颗粒。

 

　　1.3尿液DNA的提取

 

　　取120 mL尿液3 000 g离心5 min，去掉上清液，得到尿液沉渣；加入0.5 mL洗涤液（尿液DNA提取试剂盒中有配备）清洗尿液沉渣，并转移至2 mL离心管中，10 000 g离心2 min；去掉上清液，再加入1 mL洗涤液，振荡混匀，10 000 g离心2 min，再缓慢去掉上清液，得到尿液DNA样本。

 

　　使用尿液DNA提取试剂盒中的各试剂，按照说明书对样本进行DNA提取。其中，磁珠分别为用自制溶剂热法合成的Fe3O4 SiO2磁珠，试剂盒中配备的用共沉淀法生产的磁珠。

 

　　1.4 DNA分析检测

 

　　取2μL提取得到的DNA，用超微量分光光度计测定其浓度和纯度。

 

　　1.5表征方法

 

　　采用激光粒度仪（英国马尔文公司）测试样品的粒度分布；采用扫描电镜（SEM，日本电子公司）测试样品的微观形貌；采用红外光谱仪（FT-IR，布鲁克公司）分析样品的官能团；采用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES，美国安捷伦公司）分析样品的耐酸性；采用超微量分光光度计（NanoDrop One，赛默飞世尔科技公司）测定样品的浓度和纯度。

 

 

　　2.1 SEM与VSM结果对比

 

　　SEM结果显示，本研究采用溶剂热法合成的磁性微球球形度好、粒径分明且大小均一，具体如图1（a）所示；共沉淀法得到的磁性微球则由几十纳米的氧化铁团簇聚集而成，分散性不好且易沉淀，具体如图1（b）所示。

 

　　溶剂热法和共沉淀法合成磁珠的磁滞回线测试结果显示，其饱和磁化强度值分别为56.25 emu/g和30.99 emu/g，表明溶剂热法制得的磁珠的磁化强度高于共沉淀法制得的磁珠，且剩磁均接近于零，具有很好的超顺磁性。

 

 

　　2.2 SiO2包覆对Fe3O4颗粒的影响

 

　　对包覆前后的微粒进行马尔文粒度测试，结果显示，刚制备得到的裸磁性Fe3O4颗粒有多个峰出现，而经过SiO2包覆后的磁性Fe3O4颗粒只有一个峰，且呈单分散性。这表明，表面包覆SiO2能够提高微粒的分散性。

 

　　研究发现，采用溶剂热法制备的没有进行表面修饰的磁性Fe3O4颗粒，团簇粒子呈规则球状，且球形度良好，粒径均匀，但分散性不好，存在团聚现象，如图2（a）所示；最后得到的磁性Fe3O4 SiO2颗粒，粒子球形度好，粒径均一，且分散性很好，如图2（b）

 

　

 

　　2.3 FT-IR光谱分析

 

　　采用溶剂热法制备的Fe3O4纳米颗粒及Fe3O4 SiO2颗粒的红外光谱图如图3所示。与文献对比可知，Fe3O4 SiO2在1 225 cm-1和1 084 cm-1处有很强的吸收峰，对应的是Si-O-Si的不对称伸缩振动；951 cm-1处的吸收峰为Si-OH的伸缩振动；802 cm-1处的吸收峰为Si-O-Si的对称伸缩振动；469 cm-1处尖锐的吸收峰为Si-O-Si或O-Si-O的弯曲振动；而444、591、629 cm-1处的吸收峰对应的是Fe-O的弯曲振动。对比结果进一步表明在Fe3O4颗粒表面形成了SiO2[11]。

 

 

　　2.4尿液DNA提取的结果

 

　　实验分别使用由溶剂热法（solvothermal method）和共沉淀法（coprecipitation method）制得的磁珠对尿液进行DNA提取，并使用超微量分光光度计对提取到的DNA进行浓度和纯度测试。结果如表1所示。

 

　

 

 

　　3.1 FeCl3·6H2O的加入量对Fe3O4颗粒粒径的影响

       在溶剂热法工艺中增大原料FeCl3·6H2O的添加量，由20 mmol增加到30、46、54 mmol，发现粒径明显变大，如图4（a）的d（0.5）=0.464μm、图4（b）的d（0.5）=0.548μm，粒径均一性也随之变差；添加量继续增加，粒径均一性会急剧下降，如图4（c）、（d）所示。这是因为原料加入量过大会使反应刚开始形成的Fe3O4团簇在溶剂中的分散密度提高，导致Fe3O4团簇间相互碰撞融合的概率增加，进而形成更大粒径的Fe3O4颗粒[6-7]。

 

 

       3.2 SiO2包覆对Fe3O4颗粒耐酸性的影响

 

　　将Fe3O4和Fe3O4 SiO2颗粒分别分散在1 mol/L的HCl溶液中。添加Fe3O4颗粒的溶液2 h后变成透明的黄绿色，Fe3O4颗粒完全溶解消失；添加Fe3O4 SiO2颗粒的溶液，反应0、2、4、8 h后使用ICP-OES测得离心后上清液中的铁含量质量占比在百万分之0.42~0.55之间，没有显著增加。这说明Fe3O4外表面包覆了SiO2层，而SiO2壳层阻断了核心Fe3O4与HCl溶液的接触，使其无法发生反应。这说明在酸性条件下SiO2对磁性Fe3O4起到了很好的保护作用，提高了其耐酸性。

 

　　图2（b）（c）（d）为最后得到的磁性Fe3O4 SiO2颗粒，说明SiO2包覆在磁性Fe3O4颗粒表面可有效屏蔽磁力作用，较好地改善其在水和乙醇中的分散性。图2（b）为加入0.7 mL正硅酸乙酯得到的电镜图；图2（c）为加入1 mL正硅酸乙酯得到的电镜图；图2（d）为加入1.4 mL正硅酸乙酯得到的电镜图。从中可知，加大正硅酸乙酯的加入量能够提升颗粒的分散性。同时实验发现，过度加入正硅酸乙酯容易产生灵粒团聚现象，这是因为过量正硅酸乙酯易在颗粒表面成核，且长大形成SiO2微球。

 

　　研究发现，采用溶剂热法提取到的DNA的浓度和纯度均优于共沉淀法的提取成效，这是因为使用溶剂热法得到的磁珠分散性、表面包覆性、悬浮性均优于使用共沉淀法得到的磁珠。后续尝试采用溶剂热法制备磁珠，将溶剂使用量减半，发现提取浓度和纯度没有降低。

 

 

　　通过溶剂热法合成的Fe3O4 SiO2微球球形度好、粒径均匀、表面包覆良好，且有良好的耐腐蚀性。用其提取尿液DNA，提取浓度高，且A 260/A 280达到了1.87，纯度可满足后续的PCR要求。与共沉淀法相比，溶剂热法具有磁珠用量少、不易沉降、提取率高以及提取的DNA纯度高等优点。

 

 

　　［1］KUMAR N,PURI P,SHARMA D,et al.Comparison of two DNA extraction Methods and their Utility in Forensic examination of Bone samples［J］.Medico-Legal Update,2018,18(2):94-99.

 

　　［2］XIAO Y,WANG H C,LI X,et al.Research on Magnetic Separation Methods for the Extraction of Nucleic Acids［J］.Advanced Materials Research,2013,2290(662):343-347.

 

　　［3］徐冬冬,黄花.尿液游离DNA检测及其在肿瘤诊治中应用的研究进展［J］.现代肿瘤医学,2021,29(13):2347-2350.

 

　　［4］邓海月,王聪,王晓媛,等.男性X连锁Alport综合征COL4A5突变嵌合体病例报道及文献复习［J］.中华肾脏病杂志,2021,37(11):865-871.

 

　　［5］杨秋萍,李小红,闻娟,等.一例红细胞生成性原卟啉病临床分析及FECH基因检测［J］.中国麻风皮肤病杂志,2021,37(4):193-197.

 

　　［6］GENG M X,LIU F T.Preparation of Fe3O4 nanoparticles by hydrothermal method［J］.Journal of University of Jinan,2009,8(4):401-404.

 

　　［7］王雅凡,黄艳凤,杨华,等.制备硅包覆的磁性微球用于蓖麻叶DNA的提取［J］.现代生物医学进展,2010,10(17):3205-3208.

 

　　［8］孙宁,张佳林,周翔宇,等.应用磁珠法检测并提取尿液游离甲基化DNA［J］.中国医科大学学报,2015,44(10):897-900.

 

　　［9］俞丽娟,路志勇,焦章平,等.激光显微捕获技术用于尿液脱落细胞DNA检测［J］.中国法医学杂志,2011,26(05):359-361,433-434.

 

　　［10］蒋娜,汪崇文,周标,等.一种高性能磁性复合微球的制备及其在DNA提取中的应用［J］.军事医学,2016,40(6):520-524.

 

　　［11］SUN J,YU G,LIU L.Core-shell structured Fe3O4 SiO2 supported cobalt(Ⅱ)or copper(Ⅱ)acetylacetonate complexes:magnetically recoverable nanocatalysts for aerobic epoxidation of styrene［J］.Catalysis Science&Technology,2014,4(5):1246-1252.