摘要：为优化木棉树皮总黄酮的提取工艺，以木棉树皮总黄酮得率为考察指标，采用减压内部沸腾法，通过响应面法优化确定木棉树皮总黄酮的最佳提取工艺。响应面优化最佳减压内部沸腾提取工艺条件为：提取压力为0.035 MPa，解吸剂乙醇体积分数为51%，提取剂乙醇体积分数41%，液料比为61∶1，提取温度为58℃,在此条件下总黄酮得率平均值达18.45%，与预测值18.59%相比，相对误差为0.75%，证明模型理论预测值与实际值拟合效果很好。以总黄酮吸附率和解吸率为考察指标，确定AB-8为最佳树脂，并得到大孔树脂纯化的最佳条件为：上样液质量浓度为0.7 mg/mL、pH值为5，温度为30℃,体积为80 mL；吸附饱和的树脂水洗后依次用20%和70%的乙醇各100 mL进行梯度洗脱。实验结果表明，优化的木棉树皮总黄酮减压提取工艺合理、可行，大孔树脂纯化后总黄酮纯度达到82.95%，是传统醇提法的3.54倍。抗氧化实验表明木棉皮总黄酮清除超氧阴离子自由基的IC50为0.31 mg/mL，说明大孔树脂纯化的木棉皮总黄酮具有较强的清除超氧阴离子自由基的能力。
关键词：木棉树皮,总黄酮,减压内部沸腾提取,响应面法,大孔树脂纯化,抗氧化
木棉，冠有红棉、攀枝花、斑芝树等的别名，属于木棉科的落叶大乔木，原产于印度，如今在我国主要分布在云南、广西、广东等省区。木棉的皮、根、叶及花均可入药，有镇痛、抗氧化及抗癌等药理作用[1]。而植物中的黄酮类化合物是一类特殊的生物活性物质[2]，具有抗氧化性、抗菌性、抗肿瘤等作用[3-5]，有着广泛的药用价值。低温、高效提取的减压提取法已经成功应用到黄酮类化合物的提取中[6-8]。响应面法对植物有效成分提取工艺的优化起着比较重要的作用，该法主要是在单因素实验基础上，对多因素间作用进行探索进而确定最佳因素及参数，应用广泛[9-10]。大孔吸附树脂法是目前我国广泛用于植物有效成分的分离、富集最常用方法。该法工艺简单，已经应用到多种有效成分的纯化，并取得良好效果[11-13]。文献[14]报道了木棉树皮总黄酮提取率高达17.70%，且具有较强的抗氧化活性。薛中峰等[15-16]发现木棉树皮醇提取物有很好的抗肿瘤效果。如果要更好地将木棉树皮提取物应用到药品及功能性食品中，则要对其提取工艺进行优化及纯化处理。目前通过响应面实验优化木棉树皮总黄酮的提取工艺及大孔树脂纯化研究鲜见。本文在前期基础研究上以木棉树皮为原料，响应面法优化总黄酮的减压内部沸腾法提取工艺，通过静态吸附实验，结合动态吸附实验探索大孔树脂富集纯化木棉树皮总黄酮的工艺，并考察其对超氧阴离子的清除能力，以期为木棉开发成天然抗氧化剂和功能性食品提供理论和实验依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
木棉树皮（产地：崇左市，将木棉树皮清洗干净、晾干，干燥至恒重，粉碎，过60目（0.25 mm）筛，密封保存于阴凉处，备用）；芦丁标准品，纯度>98%，上海金穗生物科技有限公司；大孔树脂X-5、AB-8、NKA-9、D101，天津市光复精细化工研究所；95%乙醇、九水合硝酸铝，广东光华科技股份有限公司；亚硝酸钠、氢氧化钠、浓盐酸，成都市科龙化工试剂厂。以上试剂均为分析纯。
紫外可见分光光度计,上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SHA-C型水浴恒温振荡器，金坛市易晨仪器制造有限公司；HK-2A型超级恒温水水浴槽，南京南大万和科技有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循坏水式多用真空泵，河南省予华仪器有限公司。
1.2实验方法
1.2.1减压内部沸腾提取工艺流程
木棉树皮总黄酮的减压提取工艺见图1。
1.2.2总黄酮测定方法
参照文献[17]测定木棉树皮中总黄酮含量，以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：A=10.563m+0.009 1，其中R2为0.999 4。总黄酮得率、吸附率和解吸率的计算公式如式（1）—式（3）所示。
式中：ρ总黄酮为从标准曲线计算的总黄酮的质量浓度，mg/mL；V为提取液总体积，mL；n为稀释倍数；m为木棉树皮质量，g，ρ0为吸附前总黄酮质量浓度，mg/mL；ρ1为吸附后总黄酮质量浓度，mg/mL；ρ2为解吸液总黄酮质量浓度，mg/mL。
1.2.3响应面实验
在响应面Box-Benhnken中心组合统计理论基础上，采用Design Expert 8.0.6软件以解吸浓度、提取浓度、液料比和提取温度作为自变量，木棉树皮总黄酮得率作为因变量进行四因素三水平的实验设计，因素与水平如表1所示。
1.2.4大孔树脂纯化实验
1.2.4.1树脂的筛选与温度的选择
准确称取（湿法称重）大孔树脂（X-5，AB-8，D101，NKA-9）各1.00 g于250 mL碘量瓶中，加入50 mL一定浓度的总黄酮提取液，在温度为25℃下恒温振荡24 h后吸取上清液，按1.2.2方法进行测定，计算吸附率。将吸附后的树脂抽滤后蒸馏水洗至无色，加入一定体积的70%乙醇，恒温振荡8 h后测定上清液的吸光度，计算解吸率。同样方法考察30℃和35℃下树脂的吸附与解吸性能。
1.2.4.2上样液pH值及浓度的影响
称取AB-8树脂1.00 g置250 mL碘量瓶中，加入等量的pH分别为1、3、5、7、10的总黄酮提取液，在30℃下吸附24 h，测定吸附后上清液的吸光度，计算吸附率。5个250 mL碘量瓶中分别加入1.00 g AB-8树脂，加入等量的质量浓度分别是0.540、0.701、0.933、1.201、1.415 mg/mL的总黄酮提取液，在pH值为5、30℃恒温振荡24 h后测定吸光度，计算吸附率。按照1.2.4.1的洗脱方法进行洗脱，计算解吸率。
1.2.4.3泄漏曲线的绘制
将树脂AB-8湿法装柱（柱子规格：1 cm×30 cm（宽×高）），pH值为5，质量浓度为0.7 mg/mL的总黄酮提取液进行上柱（流速约为1 mL/min），分部收集流出液，计算吸附率，绘制泄露曲线。
1.2.4.4解吸时间的影响
在1.00 g AB-8树脂的碘量瓶中加入总黄酮提取液（0.7 mg/mL，pH=5），30℃吸附8 h，将吸附饱和后的树脂进行解吸，每隔一定时间，取上清液测吸光度，计算解吸率。
1.2.4.5洗脱剂浓度及用量的确定
体积分数分别为20%、30%、50%、70%、80%的乙醇溶液作为洗脱剂，对吸附饱和后的大孔树脂解吸8 h，测定上清液吸光度，计算解吸率。AB-8树脂动态吸附饱和后，先用100 mL蒸馏水洗脱，再用100 mL 20%乙醇洗脱，最后用70%乙醇洗脱，分部收集流出液，计算吸附率。
1.2.5两种提取方法提取液纯化比较
减压内部沸腾提取的总黄酮浓缩液按照响应面实验最佳纯化条件进行实验，收集洗脱液，并将洗脱液浓缩，称浸膏质量，50 mL 40%的乙醇溶解浸膏测定吸光度，计算浸膏得率和纯度。准确称取2.00 g木棉树皮粉末于500 mL圆底烧瓶，加入40%的乙醇100mL，回流提取两次，每次1 h，合并两次提取液。将提取液浓缩，按照减压内部沸腾提取浓缩液的纯化条件进行实验，收集洗脱液，并将洗脱液浓缩，称浸膏质量，50 mL 40%的乙醇溶解浸膏测定吸光度，计算浸膏得率和纯度。
1.2.6木棉皮总黄酮抗氧化性评价
参照文献[14]测定大孔树脂木棉皮总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率，以评价其抗氧化性。
1.3数据处理
每组实验做3次平行或重复实验，结果取平均值。采用Design-Expert 8.0.6软件对响应面实验进行设计与结果分析，采用Microsoft Excel 2010软件对树脂纯化实验进行数据处理。
2结果与分析
2.1响应面实验
2.1.1实验设计方案与结果
采用Design-Expert8.0.6软件设计的实验设计方案和实验结果如表2所示。以木棉树皮总黄酮得率为响应值，以温度、液料比、提取浓度和解吸浓度为自变量，建立四因素三水平中心组合实验设计共包括29个实验方案，其中5个相同实验，可为实验的误差进行估算。总黄酮真实得率的最高值为18.57%，最低值为16.34%，相差2.23%；而真实值与预测值相差不超过1%，说明实验结果符合实际。
2.1.2回归方程拟合及方差分析
采用Design-Expert8.0.6软件对表2实验数据进行回归分析，回归分析结果见表3，对各因素进行回归拟合后，得到回归方程为：
Y=+18.45-0.22A+0.45B+0.29C+0.27D-0.095AB+0.19AC+0.21AD+0.40BC+0.065BD-0.46CD-0.39A2-0.71B2-0.64C2-0.47D2.
回归模型的R2=0.958 3，R2Adj.=0.916 6，回归模型P<0.000 1极显著，失拟项P=0.058 6>0.05不显著，说明方程对实验有较好的拟合性，实验误差小，1.12的变异系数（CV）说明实验重现性较好，该模型可用于木棉树皮总黄酮提取的工艺优化。结果表明，木棉树皮总黄酮得率的影响次序为：料液比＞提取浓度＞解吸浓度＞温度；温度A、液料比B、提取浓度C、解吸浓度D、液料比和提取浓度交互项BC、提取浓度和解吸浓度交互项CD、温度二次项A2、液料比二次项B2、提取浓度二次项C2、解吸浓度D2二次项对响应值影响显著。
经过响应面软件分析，结合图表得到响应面最优条件为：提取温度58℃,料液比61.75，提取质量分数41.75%，解吸质量分数为51.75%，预测得率为18.59%。考虑实际情况，为进一步探讨木棉树皮总黄酮的最佳减压提取条件，将提取参数修改为：提取温度58℃,料液比61:1，提取质量分数41%，解吸质量分数51%。为求证以上实验的稳定与可靠性，依据修正后的提取参数进行5组平行实验，结果显示木棉树皮总黄酮平均得率为18.552%，与预测得率的相对误差Dr=0.19%＜1%，由此说明，预测模型与实际值有较好的拟合程度，证明该回归模型的可信度较大。
2.2树脂纯化实验结果
2.2.1树脂的筛选与温度的选择
由图2可知，30℃下4种树脂的吸附率都高，这是因为温度过低时，树脂的吸附量减少，而高温环境下黄酮类物质会有少量发生分解，且乙醇挥发量增大，不利于树脂的吸附。图3可知，在解吸性能方面25℃的解吸效果比30℃的稍高些，但相差不大，故选择30℃。综合比较30℃下4种树脂的吸附及解吸性能，吸附率：D101>AB-8>NKA-9>X-5；解吸率：AB-8>X-5>D101>NKA-9。综合考虑，选择最佳吸附树脂为AB-8树脂。
2.2.2上样液pH值及浓度的影响
如图3所示，在偏酸性的溶液下，AB-8对木棉树皮总黄酮的吸附与解吸效果较佳；在碱性条件下，随着pH值的增大，其吸附与解吸性能均下降。这可能是类黄酮化合物多为呈弱酸性的羟基酚类[18]，根据“相似相溶”的原理，总黄酮在酸性条件下容易被吸附且比较稳定[19]。因此调节上样液pH值为5进行吸附实验。随着木棉树皮总黄酮生物料浓度的增加，AB-8对总黄酮的吸附率和解吸率都减小，当生物料质量浓度达4.8 mg/mL（即上样液质量浓度为0.7 mg/mL）前，吸附率和解吸率分别达到88%和97%，但当溶液质量浓度过低时，树脂吸附不饱和，浓度过高时，树脂会处于富余状态，且溶液中的大分子杂质也会增加，易造成树脂堵塞，导致树脂吸附率下降，这样不仅浪费原材料，还给树脂的再生带来困难。故综合考虑选择0.7 mg/mL的上样液较为适宜。
2.2.3解吸时间的影响
由图4可知，当解吸时间达到10 min，解吸液中总黄酮的质量浓度就已达到0.571 mg/mL，当解吸时间达到3 h后，解吸液中总黄酮的质量浓度已基本稳定，说明基本解吸完全，继续增加解吸时间，解吸出来的总黄酮量基本不变。从工业生产操作时间及效率等方面考虑，静态解吸时间3 h为最佳。
2.2.4泄漏曲线的绘制
AB-8树脂吸附木棉树皮总黄酮的泄漏曲线见图5。图5的泄漏曲线表明：随着上样量的增加，树脂对总黄酮的吸附量增加。当上样量达到80 mL时，树脂对上样液中总黄酮的吸附率下降到90.04%，已接近泄漏点（一般允许泄露10%）[20]。超过泄漏点后继续上样，树脂对总黄酮的吸附缓慢，且随着上样量的增加，树脂的再生更加困难。因此，为减少上样液总黄酮的流失和缩短树脂的再生周期，选取80 mL为木棉树皮总黄酮最佳上样量。
2.2.5洗脱剂浓度及用量的确定
由图6可知，随着洗脱剂浓度的增加，洗脱剂对树脂的解吸能力逐渐增加，当洗脱剂质量分数由20%到80%，解吸率从61.22%增加到89.85%。为了避免总黄酮的流失，同时选择20%和70%乙醇作为梯度洗脱剂。对吸附饱和后的树脂先用蒸馏水洗去杂质，当20%的乙醇洗脱剂用量达100 mL时，解吸液中总黄酮含量较低，70%的乙醇洗脱剂用量达到80 mL时，解吸液中总黄酮含量较低。因此，20%和70%的乙醇洗脱剂的体积分别确定为100 mL和80mL。
2.3两种提取方法提取液纯化后的结果对比
两种提取方法提取液纯化后的结果对比见表4。
从表4可知，减压内部沸腾法提取木棉树皮总黄酮，AB-8树脂纯化后的浸膏得率比传统醇提法的低11.48%，但纯度是传统醇提法的3.54倍。这是因为传统醇提法提取的木棉树皮总黄酮提取液含较多杂质，总黄酮含量较低。由此可见，经减压内部沸腾法提取，大孔树脂纯化后，提高了木棉树皮总黄酮的纯度，便于后续药理活性研究。
2.4木棉皮总黄酮对超氧阴离子自由基的清除能力
由图7可知，在一定质量浓度范围内，纯化后木棉皮总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率与其质量浓度呈正相关。当质量浓度为1.0 mg/mL时，木棉皮总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率达到78.9%，IC50为0.31 mg/mL，说明大孔树脂纯化的木棉皮总黄酮具有很强的清除超氧阴离子自由基的能力，与文献黄酮抗氧化的结论相似[21]。
3结论
响应面法优化木棉树皮总黄酮的减压内部沸腾提取工艺，拟合分析确定最佳提取工艺条件：提取压力为0.035 MPa，解吸质量分数为51%，提取质量分数为41%，液料比为61∶1，提取温度为58℃,在此条件下总黄酮得率达18.45%，与模型预测值18.59%相差不大，说明响应面法适合木棉树皮总黄酮的减压内部沸腾提取工艺的优化。静态及动态吸附实验确定了AB-8大孔树脂为最佳树脂，上样液pH值为5、质量浓度为0.7 mg/mL、体积为80 mL，在30℃条件下进行吸附效果最好；吸附饱和的树脂，水洗后依次用20%和70%的乙醇溶液洗脱，体积分别为100 mL和80 mL。与传统醇提法相比，减压内部沸腾法的提取液经过AB-8大孔树脂纯化后，总黄酮纯度提高了59.55%，说明减压内部沸腾提取法有利于木棉树皮总黄酮的纯化。抗氧化实验表明，木棉皮总黄酮在清除超氧阴离子自由基的IC50为0.31 mg/mL。通过低温的减压法提取、树脂纯化，木棉皮总黄酮具有较强的清除超氧阴离子自由基的能力，具有天然抗氧化剂或功能性食品的开发利用价值。
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