摘要：随着社会生活的发展，益生菌已被广泛应用于食品、保健品等行业，冷冻干燥则是制备益生菌产品的常用方法，但菌株往往会在冻干过程中受到损伤，针对此问题，可以通过优化冻干参数、添加外源保护剂等方式，提高菌株的冻干存活率。但是，保护剂的实用效果存在菌株差异性，因此如何选择合适的保护剂是当下的研究热点。文章通过对益生菌、冷冻干燥技术、保护剂及其研究策略进行综述，以期为菌株冻干提供保护策略，实现菌株冻干保护效果最大化。
关键词：植物乳杆菌,冷冻干燥,保护剂,山梨醇,海藻糖,脉冲电场
益生菌是有益于人体健康的一类微生物，常见的益生菌可分为乳杆菌属、芽孢杆菌属、双歧杆菌属等[1]。目前，益生菌的多种健康功效已被发现，包括调节肠道菌群、提升人体免疫力、降低血脂等[2]，因此其被广泛应用于食品、医疗健康、保健品等行业，具有很大的市场潜力。
益生菌产品具有多种制备形式，如喷雾干燥、冷冻干燥、流化床干燥等，其中冷冻干燥的操作过程温度较低，可以最大程度地维持菌株活性，因此常被当作干燥的首选方法[3]。然而，冻干过程中菌株会产生损伤，如细胞膜损伤等[4]，导致冻干存活率下降，因此，研究如何减轻菌株冻干过程中的损伤具有重要意义。庞健等[5]利用响应面实验对布氏菌活疫苗的冻干工艺进行优化，使冻干存活率达到71.3%，不仅优于现有成品，而且能耗较低。添加保护剂也可以提高菌株的冻干存活率，周莉等[6]以脱脂奶粉为保护剂，对保加利亚乳杆菌进行冻干，其存活率可达85%。但保护剂具有菌株差异性[7]，如何实现给定保护剂保护效果最大化，有待进一步研究。
部分研究认为保护剂被转运到细胞内会起到更好的保护效果，但由于尚不清楚保护机制，目前该方法存在一定争议。山梨醇、海藻糖等是常用的冻干保护剂，通过生物调控可以控制它们在胞内的含量，为研究保护剂在胞内的作用提供了新思路。脉冲电场技术（PEF）能将小分子物质加载到细胞内，将保护剂有效转移至胞内。因此，文章对益生菌、冷冻干燥技术及山梨醇、海藻糖保护剂进行概述，并结合生物合成调控及脉冲电场技术，为保护剂在细胞内发挥作用提供参考，以期为提高菌株的冻干存活率提供有效策略，从而实现菌株冻干保护效果的最大化。
1益生菌简介
益生菌是一种活态微生物，只有保证到达作用位点的益生菌具有足够的数量与活性，才能发挥其益生作用[8]，其数量一般在106 CFU/mL（g）以上。益生菌主要通过调节肠道菌群（促进有益菌、抑制有害菌生长）以及产生代谢产物（分泌短链脂肪等）来发挥益生作用[9]。Guarner F等[10]发现，益生菌益生功能的发挥还受宿主肠黏膜免疫活性细胞或特定菌群相互作用的影响。
乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一种最常见的益生菌，大致可分为三大类：乳杆菌属（如嗜酸乳杆菌）、双歧杆菌属（如两歧双歧杆菌）、革兰氏阳性球菌属（如嗜热链球菌）[11]。乳酸菌属包含200多种菌类，其基因组普遍较小，一般在2~3 Mb[12]。还有一些乳酸菌，如植物乳杆菌和乳酸乳球菌，常被用作工业菌株改良模型。此外，乳酸菌还被视为程序化的细胞工厂[13]，因其可以消耗碳水化合物并产生乳酸，在工业上通常用作发酵剂。
在工业生产中，益生菌作为发酵剂使用时，其浓度和技术性能会影响产品的发酵效果。此外，在运输和储存过程中益生菌需要保持较高的存活率、酶活性和酸化能力，这对其性能的发挥效果至关重要[14]。目前，人们已经探索出各种干燥技术、封装策略，用以维持菌株在储藏及生产加工过程中的活力[15]。在实际工业生产中，冷冻干燥技术由于对菌株的维稳效果好，被当作一种最有效、最常用的方法。
2冷冻干燥技术
冷冻干燥技术（Lyophilization）也称“冻干”，是一种在真空和低温条件下对物料进行干燥处理的方法。同其他干燥技术相比，冷冻干燥可减少样品的热失活，并使冻干样品处于一个低水分含量的状态，这样更有利于维持样品稳定性[3]，常被当作菌株加工的首选方法。值得注意的是，冷冻干燥技术能耗较高，一旦操作不当就会对菌株的活性产生较大影响。因此，在生物制品的冻干过程中，应精确控制相关冻干参数，如冻干压力、冻干时间等，从而保证产品质量的稳定性。
2.1益生菌在冻干过程中的损伤
在冻干过程中，菌株会受到一定的损伤，进而影响其冻干存活率。例如，冻干过程中形成的冰晶会使细胞结构受损[16]，因此控制冻干程序的降温速率对减轻菌株损伤十分重要。另外，冻干还会导致菌株细胞膜损伤，例如细胞膜完整性破坏、流动性降低、通透性改变等[17]。冻干还会使一些蛋白质变性，导致一些关键酶活（如乳酸脱氢酶等）失活，进而对菌株活性产生不利影响。
2.2影响益生菌冻干存活率的因素
在冻干过程中，益生菌存活率的影响因素可以分为菌株自身特性及外界因素处理两个方面。在菌株特性方面，不同菌株对冷冻干燥的耐受程度不同，同一菌株的不同菌种也不相同[18]。并且，菌株形态也是冻干存活率的重要影响因素，球菌对冷冻干燥的耐受能力优于杆菌，这可能是由于球菌具有较小的比表面积[19]。此外，Corcoran B M等[20]研究表明，处于稳定期的菌株冻干存活率通常高于对数生长期的菌株。在外部因素方面，预冻持续时间、温度都会对菌株的冻干存活率产生影响[21]。因此，添加保护剂可以保护细胞及其蛋白结构，从而增强菌株对不利环境的耐受性，提高其冻干存活率[22]。此外，冻干前的一些菌株预处理方式，如调整pH、饥饿胁迫（限制营养供应）、冷热胁迫（冷热交替处理）等，能够增强菌株对冻干条件的耐受性，从而提高菌株的冻干存活率[23]。
3冻干保护剂应用及代谢研究
在冻干过程中，添加保护剂可以提升菌株的冻干存活率，但保护剂类型不同，对菌株的保护效果也不同，即保护到具有菌株差异性。保护剂转运到胞内后，能否发挥更好的保护效果以及其作用机制如何，需通过进一步研究其代谢活动来阐明。
3.1山梨醇保护剂应用及代谢研究
山梨醇（C6H14O6）是由法国化学家Boussingault在山灰浆果中发现的一种多元糖醇，其相对甜度为蔗糖的60%，在食品工业中通常被当作低热量甜味剂使用。山梨醇可通过电还原玉米淀粉进行制备，但该方法能效较低，目前多采用更为经济高效的高压催化氢化工艺合成[24]。
3.1.1山梨醇在菌株冷冻干燥中的应用
冻干过程中，添加山梨醇可以增强菌株的抗逆性，从而提高菌株的冻干存活率。Lee S B等[25]研究了不同保护剂对植物乳杆菌JH287冻干的保护效果，结果显示10%山梨醇保护剂效果最好。于小青[7]对比了添加山梨醇对植物乳杆菌冻干存活率的影响，发现菌株存活率最高提升了15%，且其对不同菌株的保护效果存在差异。此外，在冻干鼠李糖乳杆菌的储藏过程中，山梨醇也表现出了较好的保护效果[26]。目前，冻干过程中山梨醇发挥保护作用的具体机制尚不明确，但有研究指出，大多冻干保护剂是保护蛋白质的功能，作为一种质膜保护剂发挥作用的[27]，而胞内山梨醇的增加对菌株冻干的影响则有待进一步分析。
3.1.2山梨醇在菌株中的代谢调控
代谢调控是山梨醇胞内合成的一个重要途径。对乳酸菌而言，菌株中一般不会存在可检出水平的山梨醇，但特定菌株可以通过山梨醇操纵子实现对山梨醇碳源的利用[28]。如干酪乳杆菌中，山梨醇磷酸转移酶系统（PTSgut）控制着山梨醇的转运及磷酸化，并涉及两个转录调控因子（gutR和gutM）和山梨醇-6P脱氢酶的基因（gutF和sorF）编码，这些酶催化了果糖-6P的还原和氧化，但其控制山梨醇-6P去磷酸化的方式和细胞内排出的酶还有待进一步解析[29]。此外，编码山梨醇-6P脱氢酶的两个基因可以将山梨醇-6-磷酸氧化为果糖-6-磷酸，如果该反应可逆，那么从果糖中生产山梨醇就会成为可能，可以为提高山梨醇保护剂的胞内含量提供参考。
3.2海藻糖保护剂应用及代谢研究
海藻糖是一种十分稳定、非还原性的二糖，广泛存在于自然界且可从生物中分离与合成。其不仅可以作为一种储存化合物，还可作为膜与蛋白的稳定剂，具有耐冻、降低氧自由损伤等性能，还可用作生长调节剂[30]，常常被当作外部添加保护剂应用于食品加工行业。
3.2.1海藻糖在菌株冷冻干燥中的应用
海藻糖作为一种外部添加保护剂，可以增强菌株对不利环境的耐受性，从而降低菌株损伤，如30%海藻糖就可显著提高对嗜酸乳杆菌的冻干保护效果[31]。Wang G等[32]研究指出海藻糖可提高植物乳杆菌的冻干存活率，冻干后植物乳杆菌AR113存活率可达40%，且其对不同菌株的保护效果存在差异性。相关研究表明，菌株在面临环境胁迫时，海藻糖水平与菌株对抗环境胁迫的应激能力有关。如菌株在酸胁迫条件下，胞内海藻糖含量迅速上升，可以增强其对不利环境的耐受性[33]。因此，可以通过提高胞内海藻糖含量的方法来提高菌株的耐受性，从而提高其冻干存活率。
3.2.2海藻糖在菌株中的代谢调控
研究海藻糖的代谢途径，对增强其对不利环境的耐受性具有重要意义。目前，大肠杆菌中海藻糖的代谢途径已有系统的研究资料。Horlacher R等[34]研究表明，不同渗透压下海藻糖的合成途径也有所不同。在高渗透压状态下，海藻糖由otsA编码的海藻糖-6-磷酸合成酶与otsB编码的海藻糖-6-磷酸磷酸酶合成。otsA和otsB操纵子会在菌株处于静止状态或高渗透压状态时发生诱导表达，胞内产生的海藻糖被海藻糖酶treF分解并产生葡萄糖[35]，从而实现海藻糖的连续应用。而在低渗透压状态下，在磷酸转运酶系统酶域（由treB所编码的EIICB）的作用下，由treC编码的海藻糖-6-磷酸水解酶会将转运系统累积的海藻糖-6-磷酸分解为葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖[36]，以供菌株生长利用。综上代谢途径，海藻糖-6-磷酸是海藻糖合成及降解的关键代谢物，treB和tre C的抑制子treR能结合海藻糖与海藻糖-6-磷酸，并调控treB和treC的表达水平[34]，为实现海藻糖的胞内合成提供参考。
4冻干保护剂研究策略
4.1生物调控合成
菌株在面临一些不利环境条件（如温度、pH等）时，会自动调节有关基因的转录表达，从而更好地适应环境。例如，植物乳杆菌处于小鼠肠道中时，会通过转录调节来诱导合成营养因子，从而提升其对不利环境的抵抗性[37]。然而，这些营养因子合成效率较低，需要对代谢网络及糖酵解途径的生物调控模式进行分析，以提高这些营养因子的合成效率。如在代谢工程中阻止糖酵解最后阶段乳酸、乙醇等天然质子汇的产生，能有效改变糖代谢途径，使得乳酸菌的代谢产物从高乳酸转变成为高丙氨酸[38]。此外，糖酵解过程中NADH/NAD比率会受到严格调控[39]。一些菌株，如乳酸菌NAD再生能力受损时，可能会通过合成甘露醇等替代途径进行NAD再生[40]。因此，对保护剂代谢过程及糖酵解途径的生物调控模式进行研究，可以为保护剂的胞内合成提供有效参考，并有助于增加保护剂的胞内含量，以便深入研究其对菌株冻干的影响。
4.2 PEF技术
除生物调控合成，也可采用一些物理方法进行胞内保护剂的研究，如电击、渗透、磷脂相变等，它们可将小分子保护剂传送至细胞内[41]。在这些方法中，渗透耗时较长，磷脂相变效率较低，而电穿孔技术因在递送小分子物质方面潜力较大，备受研究者关注。
脉冲电场（PEF）技术具有污染小、能耗低、能最大程度地保留食品营养价值等优势，被广泛应用于微生物灭活和生物体营养提取等领域[42]。并且，PEF技术在冷冻保护方面也显示出了一定的优势，经过PEF预处理的样品，预冻时间大大缩短，有助于减轻样品在冷冻过程受到的损伤[43]。PEF在处理菌株时，会在菌株细胞膜上形成孔隙，促进胞内组分与周围环境的成分交换，实现小分子物质的传递[44]，但这种传递往往需要在可逆的电穿孔细胞中实现，不可逆的电穿孔会引发菌株死亡。此外，细胞浓度及细胞大小也会影响PEF所施加的电场强度，微小生物（1~10μm）电场施加强度为3~10 kV/cm；而大细胞需要保持100~500 V/cm的电场施加强度[45]。我们通常采用PI染料来评估PEF的加载效率[46]，因此，可利用PEF技术实现小分子保护剂的胞内传递，有效增加胞内保护剂的含量，从而提高冻干存活率。
5结语
冷冻干燥被广泛应用于益生菌产品制备领域，但由于冻干过程中菌株往往会受到损伤，如何减轻其损伤就成为了研究热点。很多研究通过添加保护剂来提高菌株冻干的存活率，但保护剂存在菌株差异性，不同菌株对保护剂的反应存在差异，因此如何优化保护效果仍是一个待解决的问题。此外，冻干过程中外源保护剂优化及有关损伤机理的研究较多，至于保护剂被转运到细胞内之后，是否能起到更好的保护效果，相关研究仍存在空白。深入研究保护剂的合成和转运途径，并结合生物调控以及脉冲电场（PEF）技术，可以深化我们对保护剂作用机制的理解，有助于揭示保护剂效果的菌株差异性，从而有效减轻菌株冻干的损伤，进一步提高菌株冻干存活率。
参考文献
［1］田云,郝娟,马永轩.食品中益生菌的功能与安全性研究进展［J/OL］.现代食品科技,1-13［2024-10-28］.https://doi.org/10.13982/j.mfst.1673-9078.2024.8.0530.
［2］钟智,徐维那,郭帅,等.复合益生菌后生元的功效及有益代谢产物的研究［J］.食品工业科技,2024,45(12):160-168.
［3］WARD K R,MATEJTSCHUK P.The Principles of Freeze-Drying and Application of Analytical Technologies［J］.Methods in Molecular Biology,2021,2180:99-127.
［4］ANANTA E,VOLKERT M,KNORR D.Cellular injuries and storage stability of spray-dried Lactobacillusrhamnosus GG［J］.International Dairy Journal,2005,15(4):399-409.
［5］庞健,许刚,郭海辰,等.应用响应面分析法优化布氏菌活疫苗的冻干工艺参数［J］.中国疫苗和免疫,2022,28(6):704-709.
［6］周莉,平洋,谭静,等.益生菌冻干保护剂及工艺优化研究［J］.食品安全质量检测学报,2021,12(15):6208-6212.
［7］于小青.植物乳杆菌在冷冻干燥过程中生理损伤及保护策略的研究［D］.上海:上海理工大学,2019.
［8］SEDDIK H A,BENDALI F,GANCEL F,et al.Lactobacillus plantarum and Its Probiotic and Food Potentialities［J］.Probiotics Antimicrob Proteins,2017,9(2):111-122.
［9］REID G.Probiotics:definition,scope and mechanisms of action［J］.Best Practice&Research Clinical Gastroenterology,2016,30(1):17-25.
［10］GUARNER F,MALAGELADA J-R.Gut flora in health and disease［J］.The Lancet,2003,361(9356):512-519.
［11］方立超,魏泓.益生菌的研究进展［J］.中国生物制品学杂志,2007(6):463-466.
［12］KLAENHAMMER T,ALTERMANN E,ARIGONI F,et al.Discovering lactic acid bacteria by genomics［J］.Antonie Van Leeuwenhoek,2002,82:29-58.
［13］De Vos W M,HUGENHOLTZ J.Engineering metabolic highways in Lactococci and other lactic acid bacteria［J］.Trends in Biotechnology,2004,22(2):72-79.
［14］BROGNA R,OLDENHOF H,SIEME H,et al.Increasing storage stability of freeze-dried plasma using trehalose［J］.PLoS One,2020,15(6):e0234502.
［15］AMINE K M,CHAMPAGNE C P,SALMIERI S,et al. Effect of palmitoylated alginate microencapsulation on viability of Bifidobacterium longum during freeze-drying［J］.LWT-Food Science and Technology,2014,56(1):111-117.
［16］NARIDA A,TSAI S,HUANG C Y,et al.The Effects of Cryopreservation on the Cell Ultrastructure in Aquatic Organisms［J］.Biopreservation and Biobanking,2023,21(1):23-30.
［17］SCHWAB C,VOGEL R,GANZLE M G.Influence of oligosaccharides on the viability and membrane properties of Lactobacillus reuteri TMW1.106 during freeze-drying［J］.Cryobiology,2007,55(2):108-114.
［18］李宝坤.乳酸杆菌冷冻干燥生理损伤机制及保护策略的研究［D］.无锡:江南大学,2011.
［19］SELMER-Olsen E,BIRKELAND S,SORHAUG T.Effect of protective solutes on leakage from and survival of immobilized lactobacillus subjected to drying,storage and rehydration［J］.Journal of Applied Microbiology,1999,87(3):429-437.
［20］CORCORAN B M,ROSS R P,FITZGERALD G F,et al.Comparative survival ofprobiotic lactobacilli spray-dried in the presence of prebiotic substances［J］.Journal of Applied Microbiology,2004,96(5):1024-1039.
［21］MIAO W N,ZHANG L.Research Progress on the Mechanism of Freeze-drying Affecting the Fermentation Activity of Lactic Acid Bacteria［J］.Science and Technology of Food Industry,2022,43(21):36-44.
［22］寇佳祥,乔建军,朱宏吉,等.提高乳杆菌属冷冻干燥存活率研究进展［J］.食品与发酵工业,2022,48(13):296-303.
［23］WANG G Q,LUO L Y,DONG C Q,et al.Polysaccharides can improve the survival of Lactiplantibacillus plantarum subjected to freeze-drying［J］.Journal of Dairy Science,2020.
［24］HAYES C.The effect of non-cariogenic sweeteners on the prevention of dental caries:a review of the evidence［J］.Journal of Dental Education,2001,65(10):1106-1109.
［25］LEE S B,KIM D H,PARK H D.Effects of protectant and rehydration conditions on the survival rate and malolactic fermentation efficiency of freeze-dried Lactobacillus plant-arum JH287［J］.Applied Microbiology and Biotechnology,2016,100(18):7853-7863.
［26］CARVALHO A S,SILVA J,HO P,et al.Survival of freeze-dried Lactobacillus plantarum and Lactobacillus rhamnosus during storage in the presence of protectants［J］.Biotechnology Letters,2002,24(19):1587-1591.
［27］MARTOS G I,MINAHK C J,DE VALDEZ G F,et al.Effects of protective agents on membrane fluidity of freeze-dried Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus［J］.Letters in Applied Microbiology,2007,45(3):282-288.
［28］OCHOA-GOMEZ J R,RONCAL T.Production of Sorbitol from Biomass［M］.Fang Z,Smith J R L,Qi X,editor,Production of Platform Chemicals from Sustainable Resources,Singapore:Springer Singapore,2017:265-309.
［29］ALCANTARA C,SARMIENTO-RUBIANO L A,MONEDERO V,et al.Regulation of Lactobacillus caseisorbitol utilization genes requires DNA-binding transcriptional activator GutR and the conserved protein GutM［J］.Applied and Environmental Microbiology,2008,74(18):5731-5740.
［30］KANDROR O,DELEON A,GOLDERG A L.Trehalose synthesis is induced upon exposure of Escherichia coli to cold and is essential for viability at low temperatures［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences,2002,99(15):9727-9732.
［31］SHU G,WANG Z,CHEN L,et al.Characterization of freeze-dried Lactobacillus acidophilus in goat milk powder and tablet:Optimization of the composite cryoprotectants and evaluation of storage stability at different temperature［J］.LWT,2018,90:70-76.
［32］WANG G,LUO L,DONG C,et al.Polysaccharides can improve the survival of Lactiplantibacillus plantarum subjected to freeze-drying［J］.J Dairy Sci,2021,104(3):2606-2614.
［33］CARDOSO F S,GASPAR P,HUGENHOLTA J,et al. Enhancement of trehalose production in dairy propionibacteria through manipulation of environmental conditions［J］.International Journal of Food Microbiology,2004,91(2):195-204.
［34］HORLACHER R,BOOS W.Characterization of TreR, the major regulator of the Escherichia coli trehalose system［J］.Journal of Biological Chemistry,1997,272(20):13026-13032.
［35］HORLACHER R,UHLAND K,KLEIN W,et al. Characterization of a cytoplasmic trehalase of Escherichia coli［J］.Journal of Bacteriology,1996,178(21):6250-6257.
［36］RIMMELE M,BOOS W.Trehalose-6-phosphate hydrolase of Escherichia coli［J］.Journal of Bacteriology,1994,176(18):5654-5664.
［37］CAO F,DING Q,ZHUGE H,et al.Lactobacillus plantarum ZJUIDS14 alleviates non-alcoholic fatty liver disease in mice in association with modulation in the gut microbiota［J］.Frontiers in Nutrition,2022,9:1071284.
［38］HOLS P,KLEEREBEZEM M,SCHANCK A N,et al. Conversion of Lactococcus lactis from homolactic to homoalanine fermentation through metabolic engineering［J］.Nature Biotechnology,1999,17(6):588-592.
［39］NISSEN L,PEREZ-MARTINEZ G,YEBRA M J. Sorbitol synthesis by an engineered Lactobacillus case i strain expressing a sorbitol-6-phosphate dehydrogenase gene within the lactose operon［J］.FEMS Microbiology Letters,2005,249(1):177-183.
［40］DE BOECK R,SARMIENTO-RUBIANO L A,NADAL I,et al.Sorbitol production from lactose by engineered Lactobacillus case i deficient in sorbitol transport system and mannitol-1-phosphate dehydrogenase［J］.Applied Microbiologyand Biotechnology,2010,85(6):1915-1922.
［41］ABAZARI A,MEIMETIS L G,BUDIM G,et al.Engineered Trehalose Permeable to Mammalian Cells［J］.PLoS One,2015,10(6):e0130323.
［42］肖健夫,张若兵,陈杰,等.方波PEF处理中负载失匹情况下波形的优化［J］.高电压技术,2014,40(1):256-261.
［43］WIKOR A,SCHULZ M,VOIGT E,et al.The effect of pulsed electric field treatment on immersion freezing, thawing and selected properties of apple tissue［J］.Journal of Food Engineering,2015,146:8-16.
［44］VAESSEN E M J,TIMMERMANS R A H,TEMPELAARS M H,et al.Reversibility of membrane permeabilization upon pulsed electric field treatment in Lactobacillus plantarum WCFS1［J］.Scientific Reports,2019,9(1):19990.
［45］LI F,CHEN G,ZHANG B,et al.Current applications and new opportunities for the thermal and non-thermal processing technologies to generate berry product or extracts with high nutraceutical contents［J］.Food Research International,2017,100(Pt 2):19-30.
［46］孙波,赵晓,冀照君,等.方波脉冲电场增强乳酸菌细胞通透性的条件优化［J］.东北农业大学学报,2013,44 (2):1-6.
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