毒力基因缺陷型大肠埃希菌 O157 :H7 毒力和耐药分析论文

　　摘要：为了解引起人类疾病的大肠埃希菌O157:H7的致病基因差别，文章在一名无其他基础疾病的腹痛、腹泻患者肛拭子中，通过细菌表型和核酸RT-PCR结合的鉴定方法，分离出一株毒力基因缺陷型大肠埃希菌O157:H7，并对其毒力及药物敏感性进行分析。文章用Taq Man Array探针微流控芯片技术进行RT-PCR核酸检测，并对患者实施排除其他胃肠道致病菌和腹泻相关病毒的检测。研究发现，从该患者肛拭子中检测并分离出的一株基因缺陷型大肠埃希菌O157:H7仅携带eae毒力基因，不携带stx毒力基因，且菌株无耐药现象。然而，这种仅携带eae基因、不携带stx基因的基因缺陷型大肠埃希菌O157:H7，仍可引起人体较为严重的腹痛、腹泻临床症状，虽然病程相对较短，无严重致死性并发症，治疗相对容易。

 

　　关键词：大肠埃希菌,多重PCR,微流控芯片技术,基因缺陷型,eae基因,非耐药株

 

　　大肠埃希杆菌0157:H7（Escherichia coli O157:H7，简称E.coli O157:H7）感染，在全球范围内具有普遍性。在北美许多地区、该菌种数量排在肠道分离病原菌的第二或第三，是血便中能分离到的最常见菌，分离率占血便的40%[1]。我国自1987年以来，新疆、北京、江苏、山东、河南、安徽等地均发现了E.coli O157:H7的散发病例。人感染E.coli O157:H7的主要途径是食用或接触被污染的牛肉、牛奶、蔬菜、水果和水源等[2]，且感染剂量极低，仅摄入5个活菌就有可能致病[3]。临床上对使用抗生素治疗E.coli O157:H7感染存在很大争议。某些抗生素被证实可有效治疗E.coli O157:H7的早期感染[4]，但也有研究从环境和人体粪便样本中分离到E.coli O157:H7耐药菌株，并发现在早期感染阶段用抗生素治疗无效。因此，在治疗前，需要准确了解其抗生素抗性，否则极有可能导致毒素释放增加，病情恶化[5]。

 

　　在本文的这名无其他基础疾病的腹痛、腹泻患者肛拭子中，通过使用科玛嘉E.coli O157显色培养基平板和改良山梨醇麦康凯培养基（CT-SMAC）分离培养、利用VITEK2 Compact 15微生物生化鉴定仪生化检测、QuantStudio 7pro扩增仪，基于多重病原菌核酸进行RT-PCR检测及血清型别凝集试验，分离出一株基因缺陷型E.coli O157:H7（菌株编号DC-2024034）。同时，用致泻大肠埃希氏菌毒力基因多重RT-PCR对其进行毒力基因检测，并实施药物敏感实验分析。此外，还用Taq Man Array探针微流控芯片技术，对样本其他胃肠道致病菌和腹泻相关病毒进行核酸多重RT-PCR检测。

 

 

　　标本介绍：患者男性，10岁；主诉：腹部脐周绞痛、腹泻，腹泻频率为3~4 h一次，粪便性状为水样便，在症状出现第二天就诊；体征：血压90/70，心率75次/min，体温37.2℃,无其他基础疾病。采集患者肛拭子双份进行致病菌和腹泻相关病毒检测，并分离出一株基因缺陷型E.coli O157∶H7。

 

 

 

　　CT-SMAC培养基；科玛嘉E.coli O157显色培养基；MUG-LST培养基；TSI琼脂；O157∶H7大肠埃希氏菌诊断血清；E.coli O157∶H7多重PCR扩增试剂；致泻大肠埃希氏菌毒力基因PCR扩增试剂；Taq Man Array探针微流控芯片PCR扩增试剂；硕世细菌DNA和病毒提取试剂；VITEK®2 Com-pact微生物生化鉴定仪；QuantStudio 7pro扩增仪；硕世SSNP-9600A核酸提取仪；DL-96A药敏分析仪。

 

　　质控菌株：E.coli O157∶H7 ATCC12900，广东环凯微生物有限公司。

 

　　以上试剂均经质控菌株测试，结果良好。

 

 

　　肛拭子无菌剪去手持部分，放入营养肉汤36℃培养6 h，后转至肠道增菌液肉汤42℃培养18 h。

 

 

　　用接种环挑取肠道增菌肉汤，分别划线接种科玛嘉E.coli O157显色培养基平板和CT-SMAC培养基平板，36℃培养24 h。分别选择科玛嘉E.coli O157显色培养基平板上圆形、光滑、中心紫色边缘灰色的小菌落和CT-SMAC培养基平板上圆形、光滑、较小且中心呈现较暗灰褐色的无色菌落，接种TSI琼脂、血琼脂，同时接种MUG-LST肉汤。分别用标准菌株大肠埃希氏菌株ATCC25922做阳性对照和E.coli O157∶H7 ATCC12900做阴性对照，36℃培养24 h。将MUG-LST肉汤管置于365 nm波长紫外灯下照射，显示菌株DC-2024034 MUG荧光阴性，且阴性、阳性对照管均结果良好易辨。在TSI琼脂中，斜面与底层均呈黄色，产气，不产H2S。

 

 

　　将上述菌株进行营养琼脂纯培养，并开展革兰染色和氧化酶实验，结果为革兰阴性、短小杆菌，氧化酶阴性。使用VITEK®2 Compact微生物生化鉴定仪表型鉴定；鉴定结果为E.coli O157。用E.coli O157∶H7诊断血清进行凝集实验，显示O157血清凝集为+++；H7血清凝集为+++。用硕世SSNP-9600A核酸提取仪、硕世提取试剂及QuantStudio 7pro扩增仪，实施E.coli O157∶H7多重PCR及致泻大肠埃希氏菌毒力基因多重PCR检测，显示菌株DC-2024034为仅携带eae毒力基因的毒力基因缺陷型E.coli O157∶H7。扩增图谱如图1所示。采用Taq Man Array探针微流控芯片技术，对检样进行其他胃肠道致病菌和腹泻相关病毒核酸RT-PCR检测，结果未检出其他胃肠道致病菌和腹泻相关病毒。用DL-96A药敏分析仪对检出菌株DC-2024034进行药敏实验，结果如表1所示。

 

　

 

 

　　对该患者进行随访，要求患者口服盐酸环丙沙星胶囊500 mg Bid，发现用药3天后腹痛、腹泻症状消失，且后期无其他并发症出现。

 

 

　　E.coli O157:H7可产生大量Vero毒素（VT-1和VT-2），也被称作志贺氏毒素（SLT），且主要与其携带的Stx基因有关。该毒素可使机体出现严重的炎症反应和组织学广泛损伤，严重时甚至还可能出现致死性的溶血性尿毒综合（Hemolytic uremic syn原drome，HUS）、血小板减少性紫癜（thromboticthrom原bocytopenicpurpura，TTP）以及导致4岁以下儿童急性肾衰[1]。本文在该名无其他基础疾病的10岁儿童腹痛、腹泻患者的肛拭子中分离出的基因缺陷型E.coli O157:H7，不携带stx毒力基因，仅携带eae毒力基因，且在检样中未检出其他能引起腹痛、腹泻的致病菌及腹泻相关病毒。结果表明，eae毒力基因可作为E.coli O157:H7独立的致病基因，引起人体较重的腹痛、腹泻临床症状，但病程相对较短，一般不会出现严重致死性并发症。经药物敏感实验分析，该菌株未出现耐药现象，不属于耐药菌株，治疗相对容易。现有研究结果表明，由于携带毒力基因的菌株广泛存在于牛、羊等动物宿主中，动物宿主在感染暴发流行中起主要作用[6]。加强肉类及奶制品等食品的E.coli O157:H7检测、监测其毒力及抗生素抗性，以及了解E.coli O157:H7的遗传特征、致病机制和耐药性，是该疾病预防、控制、临床诊断及治疗的重要手段。

 

　　本文所得菌株仅携带的eae基因，是一种被称为紧密素（intimin），分子质量为94 kDa的外膜蛋白，主要用于编码黏附因子，具有较强黏附能力，是病原菌定居并对机体造成损害的重要因素。细菌通过菌毛可有力黏附在宿主的盲肠和结肠上皮细胞的刷状缘上，并使微绒毛损害脱落，引起病变效应。这也是该菌在人肠道黏膜定居并引起病变损伤的基础。该菌株具有较强传染性，在疾病流行过程中起主要作用。然而，该菌株stx毒力基因会由于某种原因丢失，从而成为毒力基因缺陷型的弱毒株。因此，在临床和食源性疾病监测中，大肠埃希菌往往会因不产生Vero毒素而不被重视。需要注意的是，该类菌株仅携带的eae毒力基因，具有极强传染性，易造成相关疾病的广泛流行。因此，在重视携带stx毒力基因菌株同时，也不可忽视对携带eae毒力基因的基因缺陷型E.coli O157:H7的监测，这对控制相关疾病流行有着重要意义。

 

　　同时，要加强群众的健康卫生知识宣传，特别是食品加热烧熟的重要性，不食生冷变质食品，不喝生水。在出现腹泻等症状时，应及早就诊，及时规范接受治疗，并在医生指导下使用抗生素。要让群众认识到不合理使用抗生素治疗E.coli O157:H7感染性腹泻，可能会导致毒素释放增加，加重病情，诱发急性肾功能衰竭等严重后果。

 

 

　　［1］刘运德,楼永良,王辉.临床微生物学检验技术［M］.北京:人民卫生出版社,2015.

 

　　［2］林鹭芳,黄健利,钟凌.漳州市首次检出O157:H7大肠杆菌［J］.海峡预防医学杂志,2002(4):5

 

　　［3］吴家林,肖勇,凌霞,等.肠出血性大肠杆菌O157:H7多重PCR快速检测研究［J］.现代预防医学,2009,36(1):117-119.

 

　　［4］KAKOULLIS L,PAPACHRISTODOULOU E,CHRA P,et al.Shiga toxin-induced haemolytic uraemic syndrome and the role of antibiotics:a global overview［J］.Journal of In-fect,2019,79(2):75-94.

 

　　［5］MIR R A,KUDVA I T.Antibiotic-resistant Shiga tox-in-producing Escherichia coli:an Overview of prevalence and intervention strategies［J］.Zoonoses Public Health,2019,66(1):1-13.

 

　　［6］程海卫,杨霞,赵军,等.动物源E.coli O157:H7 stx基因的检测与系统进化分析［J］.中国畜牧兽医,2012,39　(10):173-180.