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摘要：通过超声波辅助低共熔溶剂提取蒲公英中的绿原酸。考察了低共融溶剂摩尔比[n（氯化胆碱）∶n（柠檬酸）]、液料比、超声功率、提取温度、超声时间对蒲公英绿原酸得率的影响。在单因素实验的基础上，通过响应面实验优化得出提取蒲公英绿原酸的最佳工艺条件为：低共熔溶剂含水量60%，n（氯化胆碱）∶n（柠檬酸）=1∶2，提取温度70℃,液料比35∶1（mL/g），超声功率300 W，超声时间42 min。在此条件下，蒲公英绿原酸的得率为2.86%±0.05%，与预测值接近2.89%接近，表明该模型可靠。同时对蒲公英绿原酸提取物抗氧化活性实验研究结果表明，蒲公英绿原酸的提取液在1~6μg/mL，DPPH自由基及ABTS+自由基的清除能力均随着浓度的增加而增大。在提取液质量浓度为6μg/mL时，两者的清除率分别为82.9%和84.2%，说明蒲公英绿原酸提取物具有较强的抗氧化活性。
关键词：蒲公英；绿原酸；低共融溶剂；超声波；抗氧化活性
蒲公英别名黄花地丁，蒲公英中的药用成分主要有绿原酸、多糖类等[1-2]。绿原酸有较强的生物活性，具有抗菌、调节糖脂代谢、抗疲劳、降血压、降血脂、清除自由基等作用[3-4]。绿原酸的提取方法有超声波提取法、酶提取法、低共熔溶剂提取法、加压提取法、微波提取法、微波提取法等[5-9]，其中低共熔溶剂提取蒲公英中绿原酸的方法鲜少报道。本研究以广西崇左市野生的蒲公英为原料，采用超声辅助低共熔溶剂提取蒲公英绿原酸，以绿原酸得率为考察指标，在单因素基础上，进行响应面优化实验，确定蒲公英绿原酸的提取最佳工艺条件，并对蒲公英绿原酸提取物进行抗氧化活性研究，为蒲公英的开发研究提供参考价值。
1实验部分
1.1试剂与仪器
1.1.1主要试剂
化学品有限公司；氯化胆碱，上海麦克林生化科技股份有限公司；一水柠檬酸，成都市科隆化学品有限公司；L（+）-抗坏血酸，成都市科隆化学品有限公司；2，2-联苯基-1苦基肼基、2.2′-（联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐，上海麦克林生化科技股份有限公司。
1.1.2主要仪器
SE-2000高速粉碎机，圣象电器有限公司；TD4低速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；UV-5500H型紫外-可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；KQ-800DB型数控超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
1.2实验方法
1.2.1绿原酸标准曲线的绘制
准确称取绿原酸标准品5.5 mg，用80%的乙醇溶解，然后转移至100 mL容量瓶中，加80%乙醇至刻度定容。混匀，制得绿原酸标准母液。分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL绿原酸标准母液于25 mL容量瓶中，加80%乙醇至刻度定容，混匀，即为标准绿原酸标准系列溶液。在200~400 nm波长范围内扫描，测定绿原酸的最大吸收波长，在327 nm处出现最大吸收波长。在最大吸收波长327 nm处测定吸光度，以80%乙醇为参比，测标准系列溶液的吸光度，每组平行3次，求取平均值。以绿原酸标准品的浓度c为横坐标，以吸光度A为纵坐标绘制标准曲线并拟合回归方程为：A=0.047 6 c-0.014 7（R2=0.999 4）。
1.2.2低共熔溶剂的配制
低共熔溶剂由氢键供体、氢键受体和蒸馏水组成。以氯化胆碱为氢键受体，柠檬酸为与氢键供体，将氢键受体与氢键供体和蒸馏水混合后，在80℃加热搅拌至澄清均一，冷却备用。
1.2.3绿原酸的提取及测定
蒲公英烘干，粉碎，过筛，准确称取1 g粉末按设定的料液比加入低共融溶剂，再按设定的工艺条件进行超声提取，抽滤，离心，取上清液稀释测定。蒲公英中绿原酸的得率y按式（1）计算。
式中：m为蒲公英粉末，g；N为稀释倍数；V为提取液体积，mL；ρ为由回归方程计算的提取液中绿原酸质量浓度，mg/L。
1.2.4单因素实验
分别对低共融溶剂摩尔比[n（氯化胆碱）:n（柠檬酸）]、液料比、超声功率、提取温度、超声时间等5个因素进行实验。固定低共融溶剂摩尔比为1:2，含水量60%，超声功率为300 W，提取温度为60℃,超声时间为30 min，分别考察低共融溶剂摩尔比（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5）、液料比[20:1、25:1、30:1、35:1、40:1（mL/g）]、超声功率（120、180、240、300、360、420 W）、提取温度（55、60、65、70、75℃)、超声时间（15、30、45、60、75 min）对蒲公英绿原酸得率影响。
1.2.5响应面法对蒲公英绿原酸提取工艺优化
根据Box-Benhnken实验设计原理，结合单因素实验结果，以蒲公英中绿原酸得率为响应值，液料比（A）、超声功率（B）、和超声时间（C）为考察因素，响应面实验因素与水平设计见表1。
1.2.6蒲公英绿原酸提取物抗氧化活性测定
1.2.6.1 DPPH自由基清除率
参考吴春燕等[10]，分别取2.0 mL质量浓度为1、2、3、4、5、6μg/mL蒲公英提取液，加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，混合均匀后避光放置30 min。以抗坏血酸作为阳性对照，在波长517 nm处测定吸光度，每组实验平行测定3次。DPPH自由基清除率计算公式见式（2）：
式中：Ao空白对照（不加蒲公英提取液）的吸光度；Ai为加入样品后的吸光度；Aj为以乙醇代替DPPH乙醇溶液的吸光度。
1.2.6.2 ABTS+自由基清除率
参考黄月等[11]，制备得浓度为7 mmol/L的ABTS储备液与浓度为2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液，各10 mL充分混合制成ABTS母液，避光反应16 h。用蒸馏水稀释使ABTS母液在734 nm处测得吸光度为0.7±0.02，即得到ABTS工作液。分别取2 mL质量浓度为1、2、3、4、5、6μg/mL蒲公英提取液与2 mL ABTS工作液混合，暗反应6 min，在734 nm处测定其吸光度，平行测定3次。ABTS自由基清除率计算公式见式（3）：
式中：Ao为空白对照（不加蒲公英提取液）的吸光度；Ai为加入样品后的吸光度。
2结果与分析
2.1低共融溶剂摩尔比对蒲公英绿原酸得率的影响
由图1可知，当低共融溶剂中含水量为60%，氯化胆碱与柠檬酸摩尔比为1:2时，绿原酸的提取率最大，故氯化胆碱与柠檬酸最佳摩尔比为1:2。
2.2液料比对蒲公英绿原酸得率的影响
由图2可知，液料比在20:1～35:1（mL/g）范围内蒲公英绿原酸的得率逐渐增加，当液料比小于35:1（mL/g）时蒲公英绿原酸的得率减少，故最佳液料比为35:1（mL/g）。
2.3超声功率对蒲公英绿原酸得率的影响
由图3可知，超声功率为180～300 W范围内蒲公英绿原酸的得率随着功率的增加而增加，当超声功率大于300 W时蒲公英绿原酸得率开始减少，故最佳超声功率为300 W。
由图3可知，超声功率为180～300 W范围内蒲公英绿原酸的得率随着功率的增加而增加，当超声功率大于300 W时蒲公英绿原酸得率开始减少，故最佳超声功率为300 W。
2.4提取温度对蒲公英绿原酸得率的影响
由图4可知，提取温度为55～70℃范围内蒲公英绿原酸的得率随着温度的升高而增加，当提取温度大于70℃时蒲公英绿原酸的得率开始减少，故最佳提取温度为70℃。
2.5超声时间对蒲公英绿原酸得率的影响
由图5可知，超声时间为15～75 min范围内蒲公英绿原酸的得率随着超声时间的增长而增加，当超声时间大于45 min时蒲公英绿原酸的得率开始减少，故最佳超声时间为45 min。
2.6响应面实验结果
2.6.1响应面实验设计
响应面实验设计及结果见表2。
用Design-Expert 13软件进行拟合分析，得到蒲公英绿原酸得率Y对A（料液比）、B（超声功率）、C（超声时间）的回归方程：
2.6.2响应面实验方差分析
响应面实验方差分析结果见表3。
由3表可知，该回归模型P值＜0.000 1，模型极显著，失拟项P值为0.253 1，说明方程拟合充分，R2=0.987 5，说明该模型拟合度好，可用于超声波辅助低共熔溶剂提取蒲公英绿原酸的工艺参数的初步分析和预测。由P值可知，A、B、C、A2、B2、C2对蒲公英绿原酸得率有极显著影响；AB对蒲公英绿原酸得率有显著影响；AC、BC对蒲公英绿原酸得率无显著影响。
2.6.3响应面最佳工艺实验条件验证
由Design Expert软件可预测蒲公英中绿原酸的最佳提取条件为：液料比36.97（mL/g），超声功率305.15 W，超声时间42.11 min，绿原酸得率为2.89%。考虑实际操作，将预测的最优提取工艺条件调整为液料比35:1（mL/g）、超声功率300 W、超声时间42 min。在此条件下平行实验3次，可得绿原酸得率平均值为2.86%±0.05%。实验数据与预测理论值基本吻合，说明该模型可以较好地指导实验。
2.7蒲公英中绿原酸提取物抗氧化活性测定分析
2.7.1 DPPH自由基清除能力
如图6所示，蒲公英绿原酸的提取液质量浓度在1~6μg/mL范围内，DPPH的清除能力随着质量浓度的增加而增大。在提取液质量浓度为6μg/mL时，DPPH自由基清除率达82.9%。表明绿原酸具有较好的抗氧化能力，但在该质量浓度下Vc溶液对DPPH自由基的清除能力高于蒲公英绿原酸提取物。
2.7.2 ABTS+自由基清除能力
如图7所示，在质量浓度为1~6μg/mL范围内蒲公英绿原酸提取物的ABTS+自由基清除能力与质量浓度呈正比关系。在提取物质量浓度为6μg/mL时，清除率达84.2%。但在该质量浓度下Vc溶液对ABTS+自由基的清除能力高于蒲公英绿原酸提取物。
3结论
本研究采用超声波辅助低共熔溶剂提取蒲公英的绿原酸，在单因素实验的基础上，通过响应面实验优化得出提取蒲公英绿原酸的最佳工艺条件为：低共融溶剂n（氯化胆碱）:n（柠檬酸）=1:2，含水量60%，液料比35:1（mL/g），超声功率300 W，提取温度70℃,超声时间42 min。在此条件下，蒲公英绿原酸的得率为2.86%±0.05%，与预测值2.89%接近，表明该模型可靠。同时对蒲公英绿原酸提取物抗氧化活性实验研究，结果表明，蒲公英绿原酸的提取液在1~6μg/mL的范围内，DPPH自由基及ABTS+自由基的清除能力均随着浓度的增加而增大。在提取液质量浓度为6μg/mL时，两者的清除率分别为82.9%和84.2%，说明蒲公英绿原酸提取物具有较强的抗氧化活性。
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