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摘要：目的：建立紫外-可见分光光度法测定灵芝菌丝中多糖含量的方法。方法：以无水葡萄糖为对照品,苯酚和硫酸为显色剂，在485nm波长处测定灵芝菌丝体中多糖含量。结果：灵芝菌丝中多糖含量0~0.115 20 mg范围内线性关系良好（R2=0.999 2），精密度RSD为1.42%。样品溶液在配制后12 h内稳定性较好,平均加标回收率为100.61%，RSD为0.97%。结论：该方法方便快捷，重现性好，结果可靠，适用于测定灵芝菌丝体中多糖含量。
关键词：灵芝菌丝；多糖含量；苯酚-硫酸法
灵芝（ganodermalucidum）也叫瑞草、仙草等，为名贵的药用真菌[1]。现代医学表明，其具有调节免疫力、抗肿瘤、抗衰老、保肝、提高机体耐缺氧能力等活性[2-6]。灵芝子实体和菌丝体中均含多糖类、三萜类、甾醇类、生物碱等多种化学活性成分，其中多糖类是其主要有效成分之一，也是大多数灵芝类产品的质量控制的指标成分[7]。
目前，市面上有很多灵芝菌丝类产品，宣传的保健功能与灵芝类似，但主要活性成分多糖的检测方法尚没有统一的国家标准，主要采用的有苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法[7-12]。但杨瑞瑞[8]报道采用蒽酮-硫酸法测定灵芝中多糖含量时易形成浑浊，无法显色测定，故本次选用苯酚-硫酸法来进行研究。本研究较系统地建立了灵芝菌丝体中多糖的含量检测方法，以期为灵芝菌丝类产品质量标准制定及产品深度开发提供参考。
1材料与仪器
1.1材料与试剂
灵芝菌丝粉，由山西瑞芝生物科技有限公司培养灵芝菌丝体，再干燥粉碎后制备。
D-无水葡萄糖，批号：110833-201506，中国食品药品检定研究院。
主要试剂：苯酚，批号160806，四川西陇科学股份有限公司；无水乙醇，批号181218，四川西陇科学有限公司；95%乙醇，批号180619，四川西陇科学有限公司；浓硫酸，批号180514，四川西陇科学有限公司；二水合磷酸二氢钠，批号160307，四川西陇科学有限公司；无水磷酸氢二钠，批号160812，四川西陇科学有限公司；糖化酶，批号105A011，北京索莱宝科技有限公司；碘化钾，批号20171205，天津市风船化学试剂科技有限公司；碘，批号2017101701，成都市科龙化工试剂厂。以上均为分析纯；水为双蒸水。
1.2主要仪器
UV-1100紫外/可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；2BP211D电子天平，德国赛多利斯公司；HH-S4数显恒温水浴锅，常州市国旺仪器制造有限公司；centrifuge 5804R离心机，德国艾本德股份公司；GL-88B旋涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。
2方法与结果
2.1溶液的制备
苯酚-硫酸分光光度测定法常用于灵芝类产品中多糖含量测定，本研究选用此法，系统地对其在灵芝菌丝粉中多糖含量测定适用性进行研究[13-15]。
1）5％苯酚溶液：精密称取5.063 50 g苯酚，加水溶解并定容至100 mL，混匀，临用新配。
2）0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH=6.5）：31.5 mL 0.2 mol/L磷酸氢二钠（称取2.839 21 g无水磷酸氢二钠加水至100 mL溶解）与68.5 mL 0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液（称取3.120 20 g二水合磷酸二氢钠加水至100 mL使溶解）混合。
3）碘液：称取130 048 g碘及3.500 71 g碘化钾，溶于10 mL水中，稀释定容至100 mL，摇匀，贮存于棕色瓶中。
4）葡萄糖标准溶液：精密称取D-无水葡萄糖标准品0.011 53 g，加水溶解并定容至100 mL，即得含0.115 2 mg/mL葡萄糖标准溶液。
5）80%（体积分数）乙醇溶液：量取421 mL 95%乙醇，加入79 mL纯净水，即得。
6）供试品溶液：按适用性考察内容及方法，精密称取混合均匀的样品约2 g，置于100 mL容量瓶中，加水80 mL，于沸水浴中加热1h，取出冷却至室温，补加水至刻度（V1），即为样品提取液。
取50 mL（V2）样品提取液，置于100 mL（V3）容量瓶中，冷却至60℃以下，加0.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液，加塞，置55~60℃下1 h，再加0.5 g糖化酶（约为样品体积的1%）于60℃以下再水解60 min后取出（用碘液检查是否水解完全，如不完全可延长水解时间至酶解液加碘液不变蓝色为止），于电炉上加热至沸（灭酶），冷却，定容，过滤，取滤液沉淀多糖。
精密吸取滤液5 mL（V4），置于50 mL离心管中，加入无水乙醇20 mL，混匀，4℃冰箱静置过夜（约14 h），以4 000 r/min离心5 min，弃去上清液，残渣用80%（体积分数）乙醇溶液洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3次。残渣用水溶解并定容至25 mL（V5），即得。
7）空白制剂溶液：按适用性考察内容及方法，精密称取混合均匀的空白制剂，按6）项下供试品溶液制备同法制备，即得。
2.2样品测定
根据适用性考察内容及方法要求，精密吸取供试品溶液1.0 mL（V6），置于25 mL比色管中，补加水至2.0 mL，加入5％苯酚溶液1.0 mL，在旋涡混合器上混匀，加入浓硫酸10 mL，在旋涡混合器上混匀，置沸水浴中2 min，冷却至室温。用分光光度计在485 nm波长处以试剂空白作参比，1 cm比色皿测定吸光度值。
多糖含量计算公式[式（1）]：
式中：X为样品中粗多糖含量，g/100g；m1为样品测定液中葡萄糖的质量，mg（可通过测定样品吸光度代入线性方程计算而得；m2为样品取样量，g；V1为样品提取液总体积，mL；V2为样品用于水解提取液体积，mL；V3为样品水解后定容体积，mL；V4为沉淀粗多糖所用样品提取液体积，mL；V5为沉淀粗多糖定容体积，mL；V6为测定用样品液体积，mL；1 000为mg与g单位换算；0.9为葡萄糖换算为粗多糖的系数。
2.3测定波长选择
精密量取葡萄糖标准品溶液和6）项下的供试品溶液和7）项下空白制剂溶液各1mL，按8）项下样品测定处理并于紫外分光光度计400~700 nm波长范围进行紫外扫描，记录紫外扫描图，详见图1。
从图1可以看出，供试品与葡萄糖标准品在485 nm±2 nm处均有最大特征吸收峰，而空白制剂溶液在485 nm波长处没有吸收。表明本品选择485 nm作为测定波长具有专属性，空白制剂溶液对检测结果没有干扰。
2.4方法学考察
2.4.1线性关系
精密吸取葡萄糖标准溶液（0.1152 mg/mL）0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL（相当于葡萄糖0.000 00、0.011 52、0.023 04、0.046 08、069 12、0.092 16、0.115 20 mg）分别置15 mL具塞试管中，按照5）样品测定处理并测定吸光度，结果见表1。
以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，见图2。
从图2可以得到，线性方程为y=500 592x-0.000 1，R2=0.999 2。表明多糖质量在0.00~0.115 20 mg范围内线性关系良好。
2.4.2精密度实验
平行称取6份供试品，按上述方法测定并计算多糖含量，结果见表2。
从表2可以看出，6份供试品的多糖平均质量分数为1.474 5%，RSD为1.42%<2%，表明此方法精密度良好。
2.4.3稳定性考察
精密称取本品1.968 73 g，按6）项制备供试品溶液，后按8）项样品测定方法处理得到显色溶液，室温下放置，分别于显色完成后的0、0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h各测定一次吸光度值，结果见表3。
以测定时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制稳定性考察曲线图，见图3。
结合表3和图3可以看出，供试品溶液显色后的吸光度值在12 h内基本稳定，RSD为0.75%＜2%，此方法稳定性符合规定。
2.4.4准确度考察
分别精密称取已知多糖质量分数为1.47％的本品3组，每组约2 g，按6）项下方法制备供试品溶液。每组3管，共9管，分别精密量取供试品溶液1 mL，置于25 mL比色管中。第一组、第二组、第三组各比色管按供试品溶液所含多糖质量的约50％、100％、150％分别添加葡萄糖标准溶液（即分别添加质量浓度为0.115 2 mg/mL的葡萄糖标准液0.13、0.26、038 mL）。标准品与样品混合后按8）项下样品测定处理并测定吸光度，计算加标回收率，结果见表4。
加标回收计算公式：
从表4可以看出，葡萄糖的平均加标回收率为100.61%，RSD为0.97%＜2%，加标回收率符合规定，表明此方法准确度良好。
3样品含量测定
取3批产品试样，每批产品平行取两份样品。精密称取样品约2 g，按6）项下方法平行制备共6份供试品溶液，按照8）项下样品测定方法测定吸光度值并按照8）项下的公式计算多糖的含量，结果见表5。
从表5可以看出，三批次产品试样每一批次产品的多糖含量均1.47 g/100 g左右，且批次内的RSD值均小于2%，此方法准确、稳定、可靠。
4结果与意义
本研究结果表明，苯酚-硫酸分光光度法测定灵芝菌丝中多糖含量，在0~0.115 20 mg范围内线性关系良好,精密度RSD为1.42%。样品溶液在配制后12 h内稳定性较好,平均加标回收率为100.61%，RSD为0.97%。此方法适用于测定灵芝菌丝体中多糖含量。
灵芝菌丝含有与灵芝相同的多糖，同样具有广泛的生理活性和良好的应用前景，且通过发酵生产，产量大，周期短，常年可行，这使其很可能成为灵芝类产品开发的又一重点[14，18]。虽然目前灵芝多糖含量的测定方法有数种，但苯酚-硫酸分光光度法应用较为广发，且被收录于原食品质量检验检疫总局和农业部颁布的相关标准[14-18]。因而，在制定灵芝菌丝类产品统一的质量标准时，应优先采用苯酚-硫酸分光光度法测定其多糖的含量。
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