基于适配体的纳米金比色法检测中药材中黄曲霉毒素B₁论文

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　　摘要：中药材贮存加工过程中易受真菌毒素污染，其中黄曲霉毒素B₁（AFB₁）以其高毒性和致癌性备受关注。制备了金纳米粒子作为基质，采用核酸适配体作为特异性识别探针，构建了一种快速可视化检测中药材中AFB₁的方法。该方法检测AFB₁的线性范围为2.5~100 ng/mL，检出限为1.87 ng/mL。应用该方法测定麦芽、决明子、三七中AFB₁的含量，加标回收率为89.1%~109.7%，相对标准偏差为3.0%~8.3%。结果表明本方法具有良好的选择性和准确性。
　　关键词：纳米金；适配体；黄曲霉毒素B₁；比色法
　　黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，具有与蛋白质和DNA结合的“双重危险”能力，是一种剧毒的真菌毒素。其中毒性最强的是黄曲霉毒素B₁（AFB₁），具有相当强的致畸、致癌、致突变作用[1]。中药材由于生产、贮存不当易受黄曲霉毒素污染，影响中药用药的安全性。2020年版《中国药典》对决明子、薏苡仁、麦芽、水蛭等24味易霉变中药材及饮片规定了AFB₁限量为5μg/kg。目前，针对中药材的AFB₁评价应用较多的是高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法[2-4]。这两种方法特异性强、灵敏度高、定量准确，但需要配置大型仪器、成本较高、耗时费力、检测过程繁琐，且需要专门的操作人员，在普适性和便捷性方面存在不足。酶联免疫吸附测定法作为一种使用便利、检测成本低的方法被用来检测AFB₁[5-6]，然而，由于酶活性不稳定，易导致检测结果出现假阳性、假阴性问题。此外，抗体生产比较昂贵费时以及储存期间的不稳定性限制了酶联免疫吸附法的实际应用。
　　核酸适配体能够特异性识别靶标分子，与抗体相比，核酸适配体具有易合成和修饰、稳定性强、生产成本较低等优点，核酸适配体与电化学、荧光法、比色法相结合的生物传感法在临床医学、化学分析、食品检测等领域得到广泛应用。其中，比色法操作简单、成本低、检测快速。
　　本文通过偶联纳米金粒子与AFB₁核酸适配体作为传感器的信号探针，构建了特异性可视化测定AFB₁的快速方法，并将其成功应用于中药材中AFB₁的检测。
　　1实验部分
　　1.1仪器与试剂
　　场发射透射电子显微镜，日本JEOL ARM-200F；紫外-可见分光光度计，UV-2450，岛津。
　　柠檬酸三钠、甲醇、氯化钠等购于上海国药集团化学试剂有限公司；氯金酸，上海泰坦科技股份有限公司；黄曲霉毒素B₁（AFB₁）、黄曲霉毒素B₂（AFB₂）、赭曲霉毒素（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）标准品，北京百灵威科技有限公司。实验中所用水为超纯水。AFB₁核酸适配体，生工生物工程（上海）股份有限公司提供，采用文献[7]报道中选用的核酸适配体，序列如下：5-AGC AGCACA GAG GTC AGA TGGTGC TAT CAT GCGCTC AAT GGGAGACTTTAG CTG CCC CCA CCTATG CGT GCTACCGTGAA-3＇，使用前于-20℃冰箱保存。
　　1.2金纳米粒子的制备
　　参考文献[8]采用柠檬酸盐还原法合成金纳米粒子（AuNPs)。100 mL 0.01%的氯金酸置于锥形瓶中，在磁力搅拌下加热至沸腾。移液器快速加入4 mL 1%的柠檬酸三钠，继续加热搅拌至溶液颜色变成酒红色稳定后，再加热10 min后停止加热，在磁力搅拌下冷却至室温。所得的AuNPs置于4℃冰箱中保存。
　　1.3比色法检测AFB₁
　　向2 mL离心管中依次加入100μL 0.5μmol/L的AFB₁核酸适配体和100μL不同浓度的AFB₁标准溶液，混匀后孵育15 min，再加入0.5 mLAuNPs孵育10 min。然后加入100μL 0.3 mol/L NaCl，反应10 min，紫外可见分光光度计检测525 nm处的吸光度值，绘制工作曲线。
　　1.4选择性研究
　　通过干扰实验验证本方法检测AFB₁的特异性。配制500 ng/mL的赭曲霉毒素（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、黄曲霉毒素B₂（AFB₂），按照1.3的步骤进行试验，测定525 nm处的吸光度值。
　　1.5中药材样品测定
　　购买于当地药店的中药材样品粉碎研磨后过筛，称取2.5 g加入离心管中，加入8 mL 70%的甲醇，涡旋充分混匀后超声20 min，离心后取上清液。重复上述步骤再次提取，合并两次提取液，浓缩至近干，然后用1 mL 70%的甲醇复溶，加入1 mL不同浓度的AFB₁标准溶液（20、100、200 ng/mL），0.45μm微孔滤膜过滤。测定吸光度值，计算回收率。
　　2结果与讨论
　　2.1方法原理
　　采用柠檬酸盐还原法合成AuNPs表面有带负电荷的柠檬酸根离子，AuNPs由于静电排斥作用呈稳定分散状态，此时溶液为酒红色。在NaCl溶液中，Na+中和AuNPs表面的负电荷从而削弱粒子间的静电作用，AuNPs发生团聚导致颜色变成蓝色。加入AFB₁核酸适配体后，核酸适配体吸附在带负电荷的AuNPs表面，阻碍AuNPs在NaCl溶液中的聚集从而起到保护作用。当体系中存在AFB₁靶标分子，核酸适配体与靶标分子高特异性结合，从而导致适配体对AuNPs的保护作用减弱，在高浓度NaCl作用下AuNPs聚集，溶液的颜色从酒红色变为蓝色，通过测定溶液吸收值可实现AFB₁浓度的定量测定。
　　2.2金纳米粒子的表征
　　按照1.2步骤所制备的AuNPs目测呈现澄清透明的酒红色，它的透射电子显微镜图见图1-2，制备的纳米金粒子具有良好的分散性，大小均匀，粒径大小约为20~30 nm。纳米金的吸收光谱图见图1-3，从图1可以看出分散的纳米金溶液在525 nm处产生较强的吸收。

　　2.3检测体系的优化
　　核酸适配体的浓度是决定检测灵敏度的关键因素。适配体浓度过低，无法对AuNPs形成有效保护，在NaCl溶液中AuNPs聚集使溶液变蓝。适配体浓度过高会造成试剂浪费同时也会影响检测的灵敏度。试验了核酸适配体浓度在0.1~5μmol/L范围内变化对吸光度的影响，结果表明，当适配体浓度大于0.5μmol/L时，吸光度大小趋于稳定。因此选择适配体的浓度为0.50μmol/L。
　　考察了NaCl浓度对AuNPs在525 nm处吸收值的影响，在0.1~0.3 mol/L范围内随着NaCl浓度的增加，溶液在525 nm处吸收值逐渐减小，之后随着NaCl浓度的增加吸收值变化不明显。考虑到过高浓度的NaCl影响检测的灵敏度，实验中选择0.3 mol/L NaCl。
　　研究了不同温度（4、25、37、50℃)对核酸适配体特异性识别AFB₁的影响，溶液在525 nm处吸收值随温度升高而降低，表明温度升高利于核酸适配体对AFB₁的识别。在实际工作中，考虑到实际应用时操作的方便可行性，选择37℃作为反应温度。
　　2.4检测性能的考察
　　在优化的实验条件下，所建立的基于适配体的纳米金比色法检测AFB₁的方法在2.5~100 ng/mL范围内呈现出良好的线性，线性方程为A=-0.008 21+0.602c，r2=0.996 3（c为AFB₁浓度，A为525 nm处吸光度值），检出限为1.87 ng/mL。
　　2.5方法的特异性研究
　　为了评估所建立的基于适配体的纳米金比色法检测AFB₁的特异性，在相同的条件下，用该方法检测400 ng/mL的OTA、ZEN和AFB₂进行对比，结果表明3种干扰毒素在525 nm处的产生的吸光度很小，证明所选用的AFB₁核酸适配体无法与OTA、ZEN和AFB₂三种毒素特异性结合，所建立的方法检测AFB₁有良好的特异性。
　　2.6中药材样品测定
　　采用所建立的方法对麦芽、决明子、三七3种中药材进行加标回收实验，加标水平为10、50、100 ng/mL。结果如表1所示，加标回收率范围是89.1%~109.7%，相对标准偏差为3.0%~8.3%。结果表明本检测方法准确可靠，可用于中药材中AFB₁的可视化快速检测。

　　3结语
　　本研究通过偶联金纳米粒子和AFB₁核酸适配体作为识别探针，建立了一种可视化检测黄曲霉毒素B₁的简便、快速的方法，实现了AFB₁高选择性、低成本的比色检测，将其成功应用于中药材中AFB₁的检测，为快速检测和高效筛查AFB₁污染提供了技术支持。
　　参考文献
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　　[2]诸晨，钱勇.高效液相色谱-质谱联用法测定薏苡仁药材中黄曲霉毒素[J].食品安全质量检测学报，2019（5）：1273-1277.
　　[3]郭舒臣，汪成，彭治添，等.UPLC-MS/MS法与HPLC-FLD法分析检测中药中的黄曲霉毒素[J].药物分析杂志，2019，39（7）：1272-1278.
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　　[5]杨艳，吴鑫，朱应飞，等.酶联免疫吸附法测定植物油中黄曲霉毒素B₁[J].食品安全质量检测学报，2018（12）：3166-3170.
　　[6]单利楠，豆小文，刘好，等.黄曲霉毒素B₁免疫快速检测技术研究进展及其在中药中的应用[J].中国实验方剂学杂志，2019（8）：194-209.
　　[7]Ma X,Wang W,Chen X,et al．Selection,identification,and applica-tion of Aflatoxin B₁aptamer[J].Eur.Food Res.Technol.,2014，238(6):919－925.
　　[8]Wang B，Zhu Q K，Liao D L，et al.Perylene probe induced gold nanoparticle aggregation[J]J.Mater.Chem.,2011,21:4821-4826.

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