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摘要：本文简要介绍了PCR引物设计的方法和注意事项。在PCR引物设计原则的基础上，简单介绍了利用DNAstar引物设计软件的基本使用方法，对该软件的基因序列导入，序列的同源性比对，引物设计，引物的BLAST以及筛选后引物的综合评价进行了论述。
关键词：PCR引物；DNAstar；引物设计原则
Design of PCR Primers Based on DNAstar Software
MA Huijuan,NIU Pengfei,GAO Hong,XU Hui,GUO Fangfang,WANG Guo (Jiangsu Test Center for Physics and Chemistry,Nanjing Jiangsu 210042)
【Abstract】：This paper briefly introduces the methods of PCR primer design and points for attention.Based on the principle of PCR primer design,the basic method of using DNAstar primer design software was introduced,including gene sequence introduction,sequence homology comparison,primer design,the primer BLAST and the comprehensive evaluation of the screened primers were discussed.
【Key words】：PCR primers;DNAstar;primer design principles
当今，动物源性食品中成分的鉴定包括的方法有很多，比如有：化学法、物理法、分子生物学方法和免疫学的方法等，这其中，最常用、最快速和灵敏的检测方法为分子生物学方法[1]。在分子生物学水平上，动物源性成分的鉴定和分析方法主要基于蛋白质和DNA分析，其中在DNA分子水平上，基于聚合酶链反应（PCR）的技术已逐渐成为食品中肉类成分动物源性成分鉴定的核心方法[2]，具有快速、简便、灵敏度高等优点，并能大大缩短目标基因的扩增时间[3]。近年来，PCR技术的蓬勃发展，对于分子生物学及相关的领域研究得到了推动和发展，在PCR技术中，引物是PCR检测所必须的，PCR是否成功，引物设计是关键的一步[4-5]。对于引物设计，我们最常用的是用引物设计软件加人工干预进行，但是虽然引物的设计软件五花八门，功能也非常完善，但是对于一名对于引物设计没有具体操作的初学者，如何选择引物软件，引物设计软件的差异以及如何操作软件设计引物都会感到比较复杂。本文拟以猪、牛、鸭、鸡、鸭的引物设计为例，深入探讨和分析DNAStar软件的引物设计原则和使用方法。
1引物设计的主要数据库和生物软件
扩增已知基因和扩增未知基因是目前引物设计中模板选择仅有的两种情况，在基因数据库中，对同一物种基因的DNA或mRNA进行搜索，以作为模板设计引物是必要的。在通常情况下，引物设计一般选择高等动植物保守功能基因区域的DNA或mRNA序列作为模板[6-7]。尽管有许多底漆设计模板，但在任何情况下都应使用底漆设计软件。通过收集大量信息资源，最常用的底漆设计数据库是NCBI（http://www.NCBI）。NLM。国立卫生研究院。生物软件包括DNAStar、dnaman、oligo6.0等[8-9]。
目前市场上的引物设计软件都具有自动搜索引物的功能，如：Premier Primer 5.0、Oligo 6.0和DNAstar等，不过使用不同的引物软件，对于设计出来的引物的长度、引物的特异性、引物的自由能都不甚相同，因此，引物设计软件自行设计出来的引物序列也不同。然而，为了获得有效的引物，应在自动搜索的基础上补充手动分析[10-11]。
2具体设计方法
2.1 NCBI搜核酸序列
登录GenBank，您可以从NCBI GenBank获取基因序列作为模板。根据检测要求确定要扩增的DNA序列，了解其编码结构基因区序列。具体方法如下：在搜索对话框中选择核苷，在对话框中填写要搜索核苷的登录号或拉丁名，如果输入牛的Nucleotide基因登录号AF039170或Gallus gallus，点击Go即得到鸡的该基因或Gallus gallus的相关的许多序列信息，从中选择物种相近的1个，点击进入，左上角选择FASTA，进入后选择右上角Send to→Complete Record→File→FASTA→Create File保存为FASTA文件或直接复制序列为TXT文件即可。
2.2将序列创建为DNAstar可读序列
打开软件DNAStar，找到其中EditSeq，这个软件就是用来打开序列的。将导出的鸡的序列FASTA文件拖拽进去，序列被成功打开，点击保存即可。或将序列从TXT文件上的序列复制后，打开EditSeq，右键新建的文件空白处，选择粘贴，出现提示，点击OK，序列就被成功创建文件，点击保存即可。
2.3序列同源性分析与比较
DNAStar软件可用于同一物种或不同物种的基因序列比较。具体步骤是：打开DNAStar，打开“MegaAlign”模块软件，在“文件”菜单中选择“输入序列”，软件可自动搜索选中的目标序列进行同源序列匹配，最终确定目标序列的同源区域。对于同源性较高的区域，系统标为红色，同源性相对较少的区域，系统标为橙色，同源性较低的区域，系统标为绿色，通过前后拖拽序列，根据颜色判断，选择同源性高的红色序列段或区域，复制该区域的碱基对并进行引物设计。该软件还可以对物种的种属关系进行排序，绘成基因树[12]。
2.4使用DNAStar软件设计引物
在DNAStar中打开PrimerSelect模块，在输入要使用的DNA、RNA或反向翻译的蛋白质模板序列后，primerselect可以在五聚体窗口中自行计算序列的熔化温度、自由能和末端自由能，还可以通过控制引物浓
度等参数来限制计算结果，盐和G的计算温度。模板处理后，primerselect根据用户定义的参数确定引物的位置，对引物进行评分，然后在模板序列上选择最佳引物序列。primer“workbench”允许修改引物并检查参数编辑对翻译阅读框、次要结果、错误引物位置和限制位置的影响。以鸡af039170基因为例设计引物。您可以从DNAStar的文件菜单中选择新建创建primerselect文件，选择并输入保存的editseq序列，打开对话框，从“demo sequences”中选择鸡af039170基因，选择打开，点击右侧的“add”，选择“done”进入新界面，从conditions中选择primer characteristics打开对话框，用于设置各种参数，如引物长度、最大3′五聚体稳定性和可接受的重叠。通常，这不会更改默认设置，您可以单击“取消”退出。打开“条件中的引物位置”对话框，从下拉菜单中的“限制位置”中选择“上引物范围”和“下引物范围”。该方法用于在全序列物种的编码区设计PCR引物。如果只是一个基因，这种方法就不能使用。单击“同意”，绿色和红色三角形对分别标记正向和反向引物的设置范围。从定位菜单中选择PCR引物对。打开一个对分窗口，上部窗口显示软件找到的31对理想引物对，引物对根据分值顺序排列。底部窗口显示上部窗口中所选引物对的备选引物对列表，如图1所示。通过拖动窗口右侧的小环打开建议窗口，您可以查看所选引物的primerselect建议。有“最佳选择”等等。在调色板工具中选择替代产品，下面的窗口显示底漆的位置和可能的不匹配，以及相应的产品长度。一根黑色粗棒表示扩增产物的数量，5和3引物的箭头表示引物是否不匹配。点击并选择“最佳选择”引物，从“报告菜单”中选择扩增汇总，打开窗口显示所选引物的PCR扩增反应报告，选择组成汇总，打开窗口显示扩增区和引物对的碱基组成。
2.5 BLAST比对
百度搜索NCBI，点击进去，右侧点击BLAST,进入找到页面下方Primer-BLAST，点击进入在Primer Parameters中把想进行引物序列比对的引物分别输入正向引物和反向引物的引物序列（或进行复制粘贴进去），PCR product size可以选择你所想要的产物的大小，比如鸡af039170所设计出来的引物，期望产物大小为100-500bp，即可输入最大和最小的核苷酸数，Primer melting temperatures(Tm)中选择退火温度范围，一般这个条件可以选择系统默认的温度范围。在Organism选项中选择所设计引物序列的种属的拉丁文名，比如鸡af039170所设计出来的引物，输入Gallus gallus，最后点击最下方的GET PRIMERS，即可得出该引物所比对出来的鸡基因所在的基因序列段以及产物大小，综合比较可以确定该引物是否合适。
2.6引物的综合评价
最后，可以依据引物的设计方法原理要求，通过DNAStar软件对所设计好的引物进行适用性分析：将DNAStar打开，点击引物选择模块，通过在报告菜单中对引物自身二聚体、引物对二聚体和引物发夹进行分析，筛选出符合要求的引物[13]。最后，通过实验验证所选择引物的好坏。通过引物合成公司对所筛选的引物进行合成，然后通过PCR扩增后经电泳跑胶，凝胶成像系统验证实验结果，若产物数量及PCR扩增的特异性和效率都很高，PCR扩增的产物与预期的PCR产物相同，同时又不会形成引物二聚体带，则表明所设计的引物符合要求。
3展望和思考
在PCR试验过程中，引物是关乎扩增产物是否成功的关键一步，引物的设计需要在PCR第一步就要完成，因此设计出来特异性强、扩增效率高的引物对于PCR试验成功与否起到至关重要的作用[14]。对于引物设计，我们需完全对照引物的设计原理，一个条件一个条件进行筛选，引物设计软件给我们带来极大的便利，可以起到事半功倍的作用，可以极大的提高我们引物设计的成功效率，但是单单靠软件设计并不能完全得到实验想要的引物，还需要人工干预，因此引物设计是一项巨大的工程。成功克隆基因的关键在于PCR反应。扩增产物必须具有高效率和特异性[15]。引物设计是一种复杂的过程，也存在一定的不确定性和偶然性，设计者只有积累足够的经验，摸索熟练使用软件，才能取得满意的结果。今天，生物信息学已经在蓬勃发展，在未来，在探索分子生物学相关研究中，将越来越深入地对PCR的技术进行研究，希望未来设计引物的工具将更加趋于简单化、灵活化、系统化和完善化。
参考文献
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