SCI论文（www.lunwensci.com）:
摘要：目的网络药理学是以“成分-靶点-疾病”相互作用网络为基础，通过网络分析，系统观察药物对疾病的影响，揭示多分子药物协同作用人体的奥秘，为剖析中药复方的作用机制提供了新方法。于是基于分子网络药理学技术，研究冠心丹参滴丸(丹参、三七、降香组成)作用于双心疾病潜在的药效物质基础和网络调控机制。方法通过PubMed数据库进行中药成分检索，将检索到的三位中药的成分分别在PubChem数据库里找到对应的ID号码，通过IPA商业数据库找到中药成分对应的靶点，并将通过OMIM数据库找到的“双心”疾病对应的靶点进行共靶点筛选，Cytoscape软件建立多成分－多基因－多疾病网络模型。结果通过文献检索和数据库检索获得冠心丹参滴丸中人参皂苷二醇型(Rb1，Rb2，Rc，Rd，Rh2)和人参皂苷三醇型(Re，Rg1，Rg2，Rh)，三七皂苷(notoginsenoside)R1，R2，R4，R5，Fa，Fc，Fe。丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA，丹参酮ⅡB，丹参酮Ⅲ，隐丹参酮，羟基丹参酮，丹参酸甲酯，丹参素，丹酚酸A，B，C，原儿茶酸，原儿茶醛及其黄酮和反式-橙花叔醇等54种特征性成分，结合OMIM获得的双心有效靶点，将权重最高的成分进行网络分析可得14种活性成分，其可以调控ESR2,MMP9,ESR1,SLC2A1，等46个与“双心”相关疾病基因的表达，涉及冠心病、心律失常、神经官能症、高血压、糖尿病、抑郁、焦虑等30种疾病。结论该研究初步从分子水平分析了心血管疾病与抑郁、焦虑等相关疾病的共性靶点，构建了冠心丹参滴丸分子－靶标蛋白--疾病网络，为冠心丹参滴丸多组分、多靶点、多途径治疗双心疾病奠定了进一步的分子理论基础。
关键词：冠心丹参滴丸；网络药理学；双心疾病；靶点
本文引用格式：刘书霞，马鲁锋，刘满姣，等.冠心丹参滴丸调控双心疾病的分子网络机制[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(98):232-236.
Molecular Network Mechanism of Guanxin Danshen Dropping Pills(GXDS)in Psycho-cardiological Diseases
LIU Shu-xia1#,MA Lu-feng2*#,LIU Man-jiao1,CHEN Yu-bao3*
(1.Beijing Computing Center,Beijing Academy of Science and Technology,Beijing;2.School of Public Health,Capital Medical University,Beijing;3.Beijing Laboratory Animal Research Center,Beijing)
ABSTRACT:Objectives Based on the compounds-target-disease network theory,network pharmacology are new approaches for systematic studying the diseases,revealing the mystery of active compounds synergistic effect and investigating the mechan-ism of traditional Chinese medicines(TCM).The main active constituents in GXDS(composed of Radix Salviae miltiorrhizae,Panax notoginseng(Burkill)and Lignum Dalbergiae Odoriferae)were identified and the mechanisms of GXDS action on psy-cho-cardiological diseases was investigated.Methods The components were searched through the PubMed database.The cor-responding ID number was checked in the PubChem database.The putative targets of psycho-cardiology were found through the IPA commercial database combined with OMIM database.Finally,it established a multi-components-target genes-diseases net-work by Cytoscape.Results The ginsenoside diols(Rb1,Rb2,Rc,Rd,Rh2)and ginsenoside triols(Re,Rg1,Rg2,Rh)and notoginsenosides R1,R2,R4,R5,Fa,Fc,Fe.Tanshinone I,tanshinone IIA,tanshinone IIB,tanshinone III,cryptotanshinone,hydroxytanshinone,methyl salicylate,danshensu,salvianolic acid A,B,C,protocatechuic acid,protocatechuic aldehydes and flavonoids et al,54 kinds of characteristic components were searched from the Pubmed.After calculating the topologic features of the nodes and edges in the created target network with OMIM database,we narrow down to 14 active components,and con-firmed GXDS worked on 46 putative targets,such as Estrogen receptor 2(ESR2)、Matrix metalloprotein-9(MMP9)、Estrogen receptor 1(ESR1)、Solute Carrier Family 2 Member 1(SLC2A1)etc.These drug-target networks involves 30 diseases such as coronary heart disease,cardiac arrhythmia,the neuroses syndrome,high blood pressure，diabetes，anxiety,depression and so on.Conclusion This study identified the common putative targets of cardiovascular disease,depression,anxiety and other related diseases from the molecular level,established the GXDS constituent identification--drug target prediction---disease pharmacol-ogy network.This method may offer an efficient way to understand the multi-compounds,multi-targets and multiple pathways mechanisms of GXDS for treatment of psycho-cardiological diseases.
KEY WORDS:Guanxin Danshen Dropping Pills;Network pharmacology;Double-heart diseases;Target
0引言
双心医学(Psycho-cardiology)又称为心理心脏病学或行为心脏病学，是研究和处理与心脏疾病相关的情绪、社会环境及行为问题的科学。美国心身医学研究所将心身疾病定义为“由环境心理应激引起和加重躯体病变的疾病”。其中明确原发性高血压、冠心病、冠状动脉痉挛、神经源性心绞痛、阵发性心动过速、原发性心动过缓、功能性期前收缩和心脏神经症等心血管疾病与精神心理因素相关，即目前所指的双心疾病范畴[1-5]。简而言之，双心疾病是指与心理心脏有关的疾病。冠心丹参滴丸是治疗双心疾病的经典验方，主要由丹参、三七、降香三味中药组成，具有活血化瘀、降脂降压的功效。相关的药理学研究表明，冠心丹参滴丸可以通过降脂降压，改善血管弹性等方式实现对动脉粥样硬化及神经源性心绞痛等疾病的治疗或控制作用[6-11]。现阶段对冠心丹参滴丸的化学成分或药效分子研究的较多，但是对其所有成分及作用机制的研究尚未进行，尤其是重要药效物质的作用途径和作用机制研究。本研究采用网络药理学的方法，借助于Ingenuity Pathway Analysis(IPA)商业数据库、0nline Mendelian Inheritance in Man(OMIM)开源数据库建立冠心丹参滴丸多成分－多基因－多疾病网络模型，阐明重要成分的作用机制，为冠心丹参滴丸多组分、多靶点、多途径治疗双心疾病奠定了进一步的分子理论基础。
1研究方法
1.1冠心丹参滴丸的活性成分的收集与确定
通过传统中药数据库和NCBI里的PubMed数据库对冠心丹参滴丸的主要活性成分进行搜索，共收集到冠心丹参滴丸的三味中药丹参（包含94种化合物）、三七（包含152种化合物）和降香（包含98种化合物）共包含344种化合物。将收集到的344种化合物依次输入到NCBI里的PubChem数据库里查找到这些化合物对应的ID号码，将三味中药中最主要成分的中文名称、英文名称、ID号码列出，如表１所示。这些最主要成分是依据参考文献研究较多的方法得到的。主要包括人参皂苷二醇型(Rb1，Rb2，Rc，Rd，Rh2)和人参皂苷三醇型(Re，Rg1，Rg2，Rh)，三七皂苷(notoginsenoside)R1，R2，R4，R5，Fa，Fc，Fe。丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA，丹参酮ⅡB，丹参酮Ⅲ，隐丹参酮，羟基丹参酮，丹参酸甲酯，丹参素，丹酚酸A，B，C，原儿茶酸，原儿茶醛及其黄酮和反式-橙花叔醇等54种特征性成分[12]。
1.2有效成分与双心疾病对应基因的确定
将所有查询到的成分的ID号码导入Ingenuity Pathway Analysis(IPA)商业数据库，并在查询时确定检索范围、选定物种、确定直接或间接相互作用等，最终检索到与导入成分对应的靶基因，表２展示了部分由Ingenuity Pathway Analysis(IPA)商业数据库查询到的化学成分对应的基因。之后在人类孟德尔遗传数据库即0nline Mendelian Inheritance in Man(OMIM)开源数据库里查找双心相关疾病对应的所有相关基因。最后将两个数据库查询到的基因通过基因ID进行匹配查询，将两个数据库得到的共同基因提取出来，这样就得到了化学成分－基因－疾病的对应关系。从表2中可以看出，丹参、三七、降香三味中药对应了三个共同基因，即ESR2、MMP9和SLC2A1三个基因。Estrogen receptor 2基因表达后是一种激素受体蛋白质，该蛋白质多存在于靶器官的细胞内，经过与激素的特异性结合形成激素-受体复合物，进而使激素发挥相应的生物学功能。这些受体在机体体内分别具有组织或和细胞特异性，并且参与很多功能的调节，如生殖、学习、记忆、认知等等。Matrix metal-loprotein-9是一种基质金属蛋白酶，因其需要金属离子作为辅助因子而得名。依据底物及片段同源性的不同，MMPs可以分为6类，包括胶原酶、明胶酶、基质降解素、基质溶解素、furin活化的MMP和其他分泌型MMP。MMP9是一种被糖化的胶原酶，可以破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中有着关键作用。Solute Carrier Family 2 Member 1蛋白是人溶质载体家族2（促进葡萄糖转运蛋白）成员1蛋白，该蛋白与动脉粥样硬化因子、脂肪因子及血管生成素有着密切的关系。
1.3冠心丹参滴丸成分－基因－疾病的网络构建
中药由于其成分的复杂多样性，因此中药治疗疾病的作用机制也比较复杂。据受体学说研究，中药中的化学成分依旧是生物活性的物质基础，其作用是通过与相关的活性功能受体结合进而发生相互作用。因此可以通过计算机及相关的专业软件来模拟成分与靶点蛋白之间的相互作用关系，这已经成为药物研究领域的一种常用的研究方法，并且也正在逐渐应用到中医药的研究领域内[13-20]。因此本研究采用专业的网络分析软件Cytoscape软件建立冠心丹参滴丸的多成分－多基因－多疾病的网络模型，该网络模型包含活性成分、基因及疾病三种网络节点。节点与节点之间的连接表示两个节点之间有相互作用，因此三种节点共体现出五种对应关系，即活性成分－基因－疾病、基因－活性成分－基因、疾病－基因－疾病、疾病－基因－活性成分、基因－疾病－基因。通过以上五种对应关系建立冠心丹参滴丸的多成分－多基因－多疾病的网络模型，进而为分析冠心丹参滴丸的成分与对应靶点及相关疾病的作用机制提供模型。
2结果分析
2.1冠心丹参滴丸有效成分相关基因信息统计
通过Ingenuity Pathway Analysis(IPA)商业数据库查询到的冠心丹参滴丸的化学成分对应的基因如表２所示。在表２中作者可以看出三位中药各自的成分对应的靶点基因的数目，其中丹参对应的靶点基因数目为35，三七对应的靶点基因数目为15，降香对应的靶点基因数目为22。同时，由表2可以看出即便三味中药的活性成分对应的基因数目及基因种类不同，但是这些基因都有一个共同的特点即这些基因所涉及到的疾病包含抑郁、冠心病、焦虑、糖尿病等等，都属于双心疾病的范畴。三味中药的活性成分对应一个共同的基因即SLC2A1基因，SLC2A1（Solute Carrier Family 2 Member 1）蛋白是人溶质载体家族2（促进葡萄糖转运蛋白）成员1蛋白，该蛋白与动脉粥样硬化因子、脂肪因子及血管生成素有着密切的关系。由于冠心丹参滴丸包含的三味中药共同对应了SLC2A1基因，而SLC2A1蛋白是与动脉粥样硬化因子、脂肪因子及血管生成素的重要关系，因此可以说冠心丹参滴丸对原发性高血压、冠心病、冠状动脉痉挛、神经源性心绞痛、阵发性心动过速、原发性心动过缓、功能性期前收缩和心脏神经症等心血管疾病与精神心理因素相关形成的疾病有着很好的治疗效果。
2.2双心疾病相关基因信息统计
通过0nline Mendelian Inheritance in Man(OMIM)开源数据库查找与双心疾病相关的基因，查找到的相关基因如表3所示。
在表3中可以看出与不同的疾病对应的基因的数目也不相同，其中高血压对应的基因数目为222，冠心病对应的基因数目为117，糖尿病对应的基因数目为106，抑郁对应的基因数目为135，焦虑对应的基因数目为88等等。表2里一共有72种基因，但是表3里双心疾病对应的基因数目远远大于表2里的基因数目，这是因为有些基因可能跟多种疾病有关，比如SLC2A1（Solute Carrier Family 2 Member 1）蛋白是人溶质载体家族2（促进葡萄糖转运蛋白）成员1蛋白，该蛋白与动脉粥样硬化因子、脂肪因子及血管生成素有着密切的关系。
2.3冠心丹参滴丸多成分－多基因－多疾病网络分析
首先分别对冠心丹参滴丸的三味（丹参、三七、降香）中药进行了网络药理学分析，如图1所示。图1中A表示的是丹参的多成分－多基因－多疾病网络图，其中蓝色节点表示的是丹参的成分，粉色节点表示的是丹参成分调控的基因，绿色节点表示丹参成分可以防治的相关双心疾病。从图中可以看出丹参成分可以调控的基因包括ESR2、IL6ST、ESR1、CYP2C19、FABP2、FABP4等，可以防治的双心疾病包括急性心肌梗死、冠心病、高血压、糖尿病、焦虑等。图1中B表示的是三七的多成分－多基因－多疾病网络图，其中蓝色节点表示的是三七的成分，粉色节点表示的是三七成分调控的基因，绿色节点表示三七成分可以防治的相关双心疾病。从图中可以看出三七成分可以调控的基因包括CASR、MMP9、ESR2、NCF1、SLC2A1、AR等，可以防治的双心疾病包括心律失常、高血压、神经综合征、急性心肌梗死、冠心病、糖尿病等。图1中C表示的是降香的多成分－多基因－多疾病网络图，其中蓝色节点表示的是降香的成分，粉色节点表示的是降香成分调控的基因，绿色节点表示降香成分可以防治的相关双心疾病。从图中可以看出降香成分可以调控的基因包括CYP2P9、ALB、ESR1、SLC2A1、CYP2C19、TTR等，可以防治的双心疾病包括糖尿病、心律失常、急性心肌梗死、高血压、冠心病、焦虑等。
为了研究冠心丹参滴丸整体对于双心疾病的调控作用，需将三味中药的成分都进行多成分－多基因－多疾病分析，由于三味中药的成分众多，调控的靶点及疾病也很多，因此作者从每味中药中提取出5种成分进而来找到其对应的靶点基因，并与通过OMIM查询到的疾病对应的基因进行整合，进而使用Cytoscape软件绘制出冠心丹参滴丸的多成分－多基因－多疾病的网络模型，如图2所示。图中最里层用菱形节点表示的是三味中药的成分，其中红色表示丹参的前5种成分，蓝色表示三七的前5种成分，紫色表示降香的前5种成分（由于懈皮素quercetin在降香成分中也排前五位，因此这里显示了降香的4种成分）；中间浅蓝色矩形节点表示的是排列在前14种中药对应的靶点基因信息；最外层绿色矩形节点表示的是靶点基因对应的相关疾病信息。从图里可以清晰的看出此14种成分主要调控ESR2、MMP9、ESR1、SLC2A1、NCF1、CDK4等46个与双心疾病相关的基因表达，调控的双心疾病主要有心律衰竭、急性心肌梗死、糖尿病、高血压、神经综合征、冠心病、焦虑等等。
2.4分子对接
对于以上活性成分调控较多的基因（蛋白）进行部分分子对接验证，这里选取了与动脉粥样硬化因子、脂肪因子及血管生成素有着密切的关系的SLC2A1蛋白与三味中药中各自排名第1（分别是danshensu、quercetin、warfarin三个分子）的分子进行分子对接，进而对这3个分子的一个共同靶蛋白SLC2A1蛋白靶点进行了验证。本研究使用Autodock_Vina程序进行半柔性的分子对接计算，即在对接过程中只改变中药成分分子的构象，而受体蛋白的结构保存不变。对接过程中受体结合位点的格点盒子的位置设置在文献报道中的位置，最后依据半经验的自由能函数从中寻找最佳的结合构象。通过分子对接发现，danshensu、quercetin、warfarin三个分子分别对SLC2A1靶点蛋白有较强的相互作用。因此作者联合Ingenuity Pathway Analysis(IPA)数据库和0nline Mendelian Inheritance in Man(OMIM)数据库给出的冠心丹参滴丸调控双心疾病的网络模型对于后续的科学研究具有一定的指导意义。
2.5KEGG富集分析
经过上述的分子对接技术验证了权重靠前的3种成分（danshensu、quercetin、warfarin三个分子）与动脉粥样硬化因子、脂肪因子及血管生成素有着密切关系的SLC2A1蛋白，证明了它们之间有较强的相互作用。但是对于网络作用机制来讲，作者对于冠心丹参滴丸成分对应的所有靶点基因进行了相关的KEGG通路富集分析，通路富集图如表4所示。通路富集图中给出了冠心丹参滴丸成分对应靶点的58种基因所涉及到的通路，在每一个通路中靶点基因都是通过其上下游基因来实现其调节功能，进而完成其错综复杂的疾病治疗途径。本研究选出一种与动脉粥样硬化因子、脂肪因子及血管生成素有着密切关系的SLC2A1基因，分析了其与糖尿病有关的KEGG通路，如图3、图4所示。对于每一个通路来讲，都包含了极为复杂的上下游调控关系，因此作者这里只给出了KEGG通路的富集分析，对应的每一个通路的调控过程将在今后的研究中逐一给出。
3结论
本研究运用网络药理学的研究方法分析了冠心丹参滴丸调控双心疾病的网络模型，结合分子对接机制进行验证，并进行了KEGG通路富集分析，发现冠心丹参滴丸中人参皂苷二醇型(Rb1，Rb2，Rc，Rd，Rh2)和人参皂苷三醇型(Re，Rg1，Rg2，Rh)，三七皂苷(notoginsenoside)R1，R2，R4，R5，Fa，Fc，Fe。
丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA，丹参酮ⅡB，丹参酮Ⅲ，隐丹参酮，羟基丹参酮，丹参酸甲酯，丹参素，丹酚酸A，B，C，原儿茶酸，原儿茶醛及其黄酮和反式-橙花叔醇等54种特征性成分，其可以调控ESR2,MMP9,ESR1,SLC2A1，等46个与“双心”相关疾病基因的表达，涉及冠心病、心律失常、神经官能症、高血压、糖尿病、抑郁、焦虑等30种疾病。
综上，本研究用计算的方法研究了冠心丹参滴丸的多成分－多基因－多疾病的网络模型，避开了中药中化学成分难分离难获取的壁垒，并为进一步的研究提供了计算假设和实验方向，大大减少实验工作量，进而降低了未来新药开发及研究的成本。因此用网络药理学的方法研究中药治病防病的作用，为传统中药赋予了新的科学内涵。
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