SCI论文（www.lunwensci.com）:
摘要：目的探究 SIRT3/SOD2 信号轴在 D-半乳糖介导的卵巢早衰中的作用。方法 将 40 只 SPF 级 BALb/c 小鼠随机均分为对照组和模型组，模型组给予 200mg/kg/d 的 D-半乳糖构建小鼠 POF 模型。对照组给予同等浓度生理盐水。两组连续注射 42 天，每天记录小鼠的体重，药物注射结束后，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清 E2、FSH、LH 和 SOD2 的水平。取小鼠的双侧卵巢，记录湿重， HE 染色计数卵巢各级卵泡，Western Blot 检测小鼠卵巢组织中 SIRT3 和 SOD2 表达水平。结果 对照组小鼠实验结束后体重显著增加； 模型组小鼠体重实验前后无明显改变；模型组小鼠卵巢系数显著低于对照组；模型组小鼠血清 E2、LH 和 SOD2 显著低于对照组；FSH 明显高于对照组；HE 染色结果显示模型组小鼠卵巢中原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和卵泡总数明显低于对照组，闭锁卵泡较多显著高于对照组；Western Blot 结果显示，与对照组比较，模型组小鼠卵巢组织中 SIRT3 和 SOD2 表达下调。结论 SIRT3/SOD2 通路在 D- 半乳糖介导的卵巢早衰中发挥重要作用。
关键词：卵巢早衰；D-半乳糖；沉默信息调节因子 3；ROS；SOD2
本文引用格式：王翠丽，韩艳军，刘小虎，等. SIRT3/SOD2通路在D-半乳糖介导的卵巢早衰中的作用[J]. 世界最新医学信息文摘, 2019, 19(98):278-280.
To Explore the Pathway of SIRT3/SOD2 on Regulating the Mice of Premature Ovarian Failure
WANG Cui-li, HAN Yan-jun, LIU Xiao-hu, ZHOU Yue*
(Department of Pre-clinical College, Dali University, Dali Yunnan)
ABSTRACT: Objective To explore the expression of SIRT3/SOD2 in D-galactose-induced premature ovarian failure. Methods Construct mice premature ovarian failure by D-galactose for 42 days，and recording the weight everyday. After the injection，then take blood by removingeyeball, ELISA was used to measure the serum levels ,including estrogen(E), follicle-stimulating hormone（FSH）, luteinizing hormone(LH), and superoxide dismutase(SOD2) . HE staining was used to test morphological changes of ovaries and record the follicles at each levels. Western Blot were used to detect the expression of silent information regulator 3(SIRT3) and SOD2. Results The mice in the control group gained significant weight after the end of the experiment,and the weight of model group was no obvious change；The ovary coefficient of the model group was significant lower than that of the control group. Compared with the control group,the level of E2, LH and SOD2 were significantly lower in the model group,and the level of FSH was significantly higher, The results of Ovarian HE staining showed that the number ofprimordial follicle,primary follicles, secondary follicles and thetotle number follicles of the model group was significantly lower than that of the control group,and the number of atresia follicles was significantly higher than that of the control group.The results of Western Blot showed that compared with the control group, the expressions of SIRT3 and SOD2 in the ovarian tissues of the model group were down-regulated. Conclusion SIRT3/SOD2 pathway plays an important role in D-galactose induced ovarian failure.
KEY WORDS: Premature Ovarian Failure; D-Galactose; Silent Information Regulator 3; Superoxide Dismutase 2
0引言
卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是导致女性不孕不育症的重要病因 [1] ，POF 的病因复杂，卵巢组织中氧化物质（ROS）与抗氧化物质（SOD2、CAT）失衡是 POF 的重要致病机制 [2]。SIRT3（Silent Information Regulator 3，沉默信息调节因子 3）对维持线粒体功能具有重要的作用，而线粒体功能障碍是机体衰老过程的关键环节，SIRT3 通过调节 SOD2（superoxide dismutase2，超氧化物歧化酶 2）的去乙酰化发挥清除 ROS 的作用 [3]。本课题运用 D-半乳糖诱导构建小鼠卵巢早衰的模型，检测衰老调控因子 SIRT3 和 SOD2 在小鼠早衰模型卵巢中的表达， 探索 SIRT3/SOD2 信号通路在卵巢衰老过程中的调控作用，旨在为 POF 的机制研究和临床 POF 治疗提供实验依据。
1材料与方法
1.1材料
40 只 SPF 级 BALb/c 雌性小鼠，周龄 8-10 周，体重 22-27g,（由昆明医科大学实验动物中心提供，安全证书编号： SYXK(滇)k2015-0002）；D-半乳糖（如吉生物科技有限公司）； ELISA 免疫试剂盒 （北京丽科）；SIRT3（Abcam 美国）；内参一抗（GAPDH Abcam 美国）；HRP 二抗(Sigma 美国)；蛋白裂解液（Applygen 公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）； ECL 发光试剂盒（Pierce 公司）；HE 染色剂（上海瑞赛）。MiniPROTEAN 3 垂直凝胶电泳槽（Bio Rad美国）165-8001 印迹电泳转移系统（Bio Rad 美国）；GelDocItTS2凝胶成像和分析系统（Bio Rad 美国）；离心机（TG16-WS 湘仪离心仪器公司）；电子分析天平（XB120A Precisa 瑞士）；多功能酶标仪（Thermo）；石蜡切片机（江苏天琼）；普通光学显微镜(Nikon)。
1.2方法
1.2.1造模及给药将 40 只雌性小鼠随机分为对照组和模型组，每组 20 只。模型组每天上午（8：00-10:00）给予颈背部皮下注射 200mg/kg/d 的 D-半乳糖溶液，对照组相同部位注射注射等剂量的生理盐水，两组均连续注射 42 天。每天上午记录小鼠的体重。
1.2.2血清激素的测定药物注射结束后禁食 24h，摘取小鼠眼球，采取血浆，血液静置 2h 后，3500r/min，离心 5min，吸取上层血清，严格按照 ELSIA 试剂盒的操作，测定血清 E2、FSH、LH 和 SOD2 的水平。
1.2.3HE 染色与卵泡计数颈椎脱位处死小鼠，取出小鼠的双侧卵巢，剔除周围多余的脂肪组织，并称取湿重，计算小鼠卵巢系数（卵巢系数=卵巢湿重（mg）/小鼠体重（g）×100%）。然后将卵巢置于 10%的中性福尔马林中固定，经过梯度酒精脱水， 二甲苯透明，浸蜡，包埋。纵向连续切片，厚度 5μm，每只小鼠取 2 张。经过脱蜡和水化处理后，进行常规 HE 染色。在普通光学显微镜下进行卵泡计数，包括原始卵泡(primordial fol- licle)，初级卵泡（premary follicle）、次级卵泡（secondary follicle） 和闭锁卵泡（atresic follicle），最后计数卵泡总数(Total follicles)。
1.2.4Western Blot 检测卵巢组织中 SIRT3/SOD2 的表达收集小鼠卵巢组织，剪碎研磨成匀浆，离心提取蛋白，按 BCA 蛋白浓度测定试剂盒方法，测定总蛋白的浓度。取等量总蛋白经SDS-PAGE 电泳分离后转移至 PVDF 膜,5%脱脂奶粉封闭 2h，加入兔抗鼠 SIRT3（1:200），4℃过夜，TBST 缓冲液充分漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1:5000），室温反应 2h，TBST 充分洗膜 3 次，ECL 增强发光试剂显色后，于凝胶成像系统曝光，显影定影后观察结果。
1.3统计学处理
应用 SPSS 17.0 统计软件对实验数据进行数据分析，采用两独立样本的 T 检验，数据结果均以 x s 表示，P<0.05 表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1一般情况对照组精神状态良好，毛色亮泽顺滑，二便正常； 模型组小鼠，体型消瘦，精神萎靡，不喜动，毛色灰暗粗糙， 出现稀便。
2.2体质量变化对照组小鼠实验后体重与实验前相比增加（P=0.000），模型组小实验前后体重无明显改变（P=0.141），差异无统计学意义。结果见图 1。
2.3卵巢系数 与对照组比较，模型组小鼠卵巢系数较低（P=0.000），差异具有统计学意义，结果见图 2。
2.4性激素与 SOD2ELISA 方法检测结果显示，与对照组比较， 模型组的血清 E、LH 及 SOD2 浓度较低，而模型组小鼠血清 FSH 浓度高于对照组，差异具有统计学意义（P=0.005、P=0.025、P=0.003、P=0.001），见表 1。
2.5两组小鼠卵巢形态学改变与对照组相比，模型组小鼠卵巢原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和卵泡总数明显低于对照组（P=0.000、P=0.009、P=0.000、P=0.000），闭锁卵泡明显高于对照组(P=0.000),差异具有统计学意义。结果见图 3、4、5。
2.6WesternBlot 检测 SIRT3 和 SOD2 的表达与对照组相比，模型组小鼠卵巢中的 SIRT3 和 SOD2 的表达均下调（P<0.05），差异具有统计学意义，结果见图6。
3 讨论
随着生活节奏的加快，生活压力的增大，社会竞争日益激烈，导致女性心理紧张和焦虑，引发的生殖系统的疾病也日益增加。若在 40 岁之前出现不明原因的月经稀发，≥4 个月以上的闭经，被成为卵巢早衰。近年来发病率逐年上升并且出现年轻化的趋势。POF 若不及时有效的治疗，会引起患者的内分泌和排卵障碍，甚至导致不孕，长期低雌激素水平也会增加患者心血管疾病和骨质疏松的风险[4]，给女性的生活和心理带来极大的伤害。本课题组运用 D-半乳糖构建小鼠卵巢早衰的模型，探索 SIRT3/SOD2 通路在卵巢衰老过程中发挥的作用，为 POF 分子机制的研究提供实验依据，为临床 POF 的治疗提供新靶点。目前卵巢早衰的发病机制仍不清晰，良好的 POF 模型为临床 POF 的发病机制、临床诊断、防治策略和药物选择上提供重要的实验依据。研究表明发现摄入过多的 D-半乳糖会产生与自然衰老相似的症状[5]，所以本实验通过对 BALB/c 小鼠注射颈背部皮下注射 D-半乳糖构建 POF 模型。其优势在于操作方法简单，造模时间短，小鼠生存能力强，成模率高，卵巢形态改变与人类 POF 相似。BALB/c 小鼠连续给予 D-半乳糖注射 42 天，实验结果显示模型组小鼠体重增加不明显，卵巢系数低于对照组，血清激素 LH,E2,SOD2 均明显低于对照组，FSH 明显高于对照组。卵巢 HE 染色显示模型组小鼠卵巢原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和卵泡总数少于对照组，而闭锁卵泡数目高于对照组， 以上结果说明利用 D-gal 诱导可成功构建 POF 模型。
研究表明[6]SIRT3 在线粒体能量代谢、氧化应激等反应中扮演着重要角色，其主要通过线粒体中大部分蛋白质的去乙酰化作用，维持体内 ROS 稳定从而调控着机体生理与病理的过程[7]。研究发现[8] 卵巢功能下降的患者或者中老年女性卵巢中的SIRT3 的表达减少，若敲除卵巢中的 SIRT3，卵巢内的 ROS 水平升高[9]，说明卵巢功能减退与 SIRT3 的表达量降低有明显的关系。SIRT3 主要通过直接去乙酰化 SOD2，提高 SOD2 的活性[10]， 也可通过对 Foxo3a 的去乙酰化，提高其下游分子 SOD2 及 CAT的 mRNA 的表达，提高线粒体清除活性氧的能力，抑制细胞内ROS 的蓄积，从而抑制衰老[11-12]。正常情况下内源性的抗氧化酶如 SOD2，CAT，GSH-Px 等通过协同作用及时的清除多余的ROS，使得氧化与抗氧化系统处于动态平衡。SOD2 将超氧化物转化为过氧化物，再经 CAT 转化为水[13]。在衰老过程中随着 ROS 等的产生，SOD2、CAT、GSH-Px 等抗氧化酶被消耗，所以可通过检测抗氧化酶 SOD2 的表达了解卵巢衰老的情况[14-15]。本实验通过 ELISA 法测定血清 SOD2 的浓度，Western Blot 检测卵巢 SIRT3 和 SOD2 的表达，结果显示模型组 SIRT3 和 SOD2 蛋白表达水平低于对照组，血清 SOD2 浓度也低于对照组，由此推测D-半乳糖可能降低了卵巢 SIRT3 和 SOD2 的表达，降低了其清除 ROS 的能力，从而介导卵巢衰老的发生。
本实验通过 D- 半乳糖构建小鼠卵巢早衰的模型， 探索SIRT3/SOD2 通路在卵巢衰老过程中所发挥的作用，与对照组比较，模型组小鼠卵巢发生衰老形态学改变， LH 和 E2 的水平降低，衰老相关调控因子 SIRT3 和 SOD2 的表达下调，结果提示 D-半乳糖诱导能有效构建小鼠卵巢早衰的模型，D-半乳糖可通过降低卵巢组织中 SIRT3 和 SOD2 的表达，影响卵巢组织内氧化与抗氧化系统的平衡，导致卵巢早衰的发生，这为 POF 机制研究和临床 POF 的诊疗提供了新思路。
参考文献
[1]Gowri,A L,Shukri M,Al-Farsi,et al.Aetiological profile of women presenting with premature ovarian failure to a single tertiary care center in Oman[J].Post Reprod Health,2015,21(2):63-68.
[2]Firestein R,Blander G,MICHAN S,et al.The SIRT1deacetylase suppresses intestinal tumorigenesis and colon cancer growth[J].PloS One,2008,3(4): e2020.
[3]李天杰,乔杰.SIRT3 与女性生育力的研究进展[J].国际生殖健康/计划生育杂志,2018,37(06):75-78.
[4]洪壤,严萍.卵巢早衰激素补充治疗临床探讨[J].临床医药文献电子杂 志,2019(5).
[5]Peng X Y ,Kong B H ,et al .Protective effect of whey protein hydrolysates against oxidative stress in D-galactose-induced ageing rat[J] .Int Dairy J,2014, 34(34):80-85.
[6]Firestein R,BlanderG,MichanS,et al.The SIRT1 deacetylase suppresses intes- tinal tumorigenesis and colon cancer growth[J].PloS One,2008,3(4):e2020.
[7]马颖.SIRT3 通过抑制 P53 改善线粒体自噬对衰老心肌发挥保护作用的机制研究[D].2015.
[8]Pacella-Ince L,Zander-Fox DL,LanM.Mitochondrial SIRT3 and its target glutamate dehydrogenase are altered in follicular cells of women with re- duced ovarian reserve or advanced maternal age[J].Hum Reprod,2014,29(7): 1490-1499.
[9]Koch S,AcebronSP,HerbstJ,et al.Post-transcriptional Wnt Signaling Governs Epididymal Sperm Maturation [J].Cell,2015,163(5):1225-1236.
[10]QiuXL,BrownK,HirscheyMD,et al.Calorie restriction reduces oxidiative stress by SIRT3-mediated SOD2 activaction[J].Cell Metab,2010,12(6): 662-667.
[11]Bandyopadhyay S,Chakrabarti J,Banerjee S.Galactose toxicity in the rat as a model for premature ovarian failure:an experimental approach read-dressed [J].Hum Reprod,2003,18(10):2031-8.
[12]Sundaresan N R,GuptaM,Kim,et al.Sirt3 blocks the cardiac hypertrophic response by augmenting Foxo3a-dependent antioxidant defense mechansims in mice[J].J Clin Invest,2009,119(9):2758-71.
[13]ScandaliosJG.Oxidative stress :molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses[J].Brazilian J Med Biol Res,2005, 38(7):995-1014.
[14]周意,栾洁,蒋静娴,等.玛咖多糖对 D-半乳糖衰老模型小鼠免疫器官的保护作用[J].中国实验方剂学杂志,2016(19):121-125.
[15]曹艳玲,李文兰,韦灵玉,等.环黄芪醇对 D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(19):208-211.
关注SCI论文创作发表，寻求SCI论文修改润色、SCI论文代发表等服务支撑，请锁定SCI论文网！ 文章出自SCI论文网转载请注明出处：https://www.lunwensci.com/yixuelunwen/25400.html
