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摘要：神经退行性疾病是由于大脑和脊髓中的神经元或其髓鞘丧失所导致的疾病状态并随着时间的推移而逐渐恶化，最终导致神经功能障碍，最常见的神经退行性疾病包括帕金森病、阿尔茨海默病、亨延顿舞蹈病，然而大部分神经退行性疾病发病机制复杂，疾病模型难以构造，导致人们对于其研究进展缓慢。经过多年的研究，科研人员发现了细胞程序性坏死在神经退行性疾病发生发展中的作用。程序性坏死是一种不同于凋亡的新型细胞死亡方式，其作用机制为TNF-α与TNF受体的结合，复合体I和复合体II的形成，Caspase8的活性抑制以及RIPK1-RIPK3-MLKL组成的坏死小体的形成，MLKL的磷酸化及其在细胞膜结构的锚定，导致膜的破裂并最终介导细胞的坏死性死亡。最近的文献中报道了一些有关程序性坏死与神经退行性疾病发生之间的联系，因此本文将主要叙述程序性坏死分子机理以及其在神经退行性疾病中的研究进展。
关键词：细胞程序性坏死；TNF-α；神经退行性疾病
本文引用格式：吴轶群,徐翀,魏立彬.细胞程序性坏死机制及其在神经退行性疾病发生发展中的作用[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(78):52-54.
The Mechanism of Programmed Cell Necrosis and its Role in the Development of Neurodegenerative Diseases
WU Yi-qun,XU Yi*,WEI Li-bin*
(Xuanwumen Campus,Chinese Pharmaceutical University,No.24 Tongjiaxiang,Gulou District,Nanjing,Jiangsu Province,Key Laboratory of Oncology and Intervention,Nanjing Jiangsu)
ABSTRACT:Neurodegenerative disease is a kind of disease which is caused by the loss of neurons or myelin in the brain and spinal cord and gradually deteriorates over time,eventually leading to neurological dysfunction.The most common neurodegenerative diseases include Parkinson's disease(PD),Alzheimer's disease(AD),and Huntington's disease(HD).Due to the mechanisms of neurodegenerative diseases are complicated and the modules of them are hard to construct,great progresses have not been made to discover this kind of disease.For many years of research,researches have discovered how necroptosis leads to neurodegenerative diseases.Differ from apoptosis,necroptosis is a brand new way of cell death and the mechanism of which include the combination of TNF-αand TNF receptors,the formation of ComLpex I and ComLpex II,the inhibition of Caspase8,the formation of necrosome composed of RIPK1,RIPK3 and MLKL,the phosphoralation of MLKL and its anchoring on the membrane structures of cells,inducing the rupture of membrane and the necrotic death of cells.Recent files reported the relation between necroptosis and neurodegenerative diseases,so our article will mainly introduce the molecular mechanisms of necroptosis and its researching progresses in neurodegenerative diseases.
KEY WORDS:Necroptosis;TNF-α;Neurodegenerative diseases
1程序性坏死的发展简述
细胞死亡是科研人员长期研究的热门课题之一。细胞死亡对于多细胞生物的发育，体内平衡的维持和对微生物感染的防御是必不可少的[1]，最为经典的细胞死亡方式主要有凋亡（Apoptosis），坏死（Necrosis）以及自噬（Autophagy）。凋亡是最早被科研人员认识到的细胞程序性死亡（Programmed Cell Death），其主要特征是凋亡小体的形成，细胞核的浓缩和破裂以及DNA的破裂[2]，而直到2009年科研人员对介导坏死信号通路的重要蛋白RIPK3(Receptor-interacting protein kinase 3)进行了深入研究之后[3-5]，细胞的程序性坏死（Necroptosis）才走入了更多人的视野[6,7]，与凋亡不同，程序性坏死以细胞膜的破损，细胞和细胞器的肿胀为主要特征[8]，其信号通路主要由RIPK1（Receptor-interacting protein kinase 1）-RIPK3（Receptor-interacting protein kinase 3）-MLKL（Mixed lineage kinase domain-like protein）介导，三者形成了一种名为坏死小体（Necrosome）的复合物，导致坏死的发生[5]。
2程序性坏死的起始信号通路
肿瘤坏死因子（TNF-α）是一种重要的炎性细胞因子[9]，被认为具有引起肿瘤细胞程序性坏死的能力[6]，TNF超家族（TNFSF）目前由19个配体组成，而与这些配体结合的TNF受体（TNFR）超家族（TNFRSF）由29个相关受体组成，这些受体与配体之间的相互作用介导控制免疫和非免疫细胞的存活，增殖，分化和信号传导[10]。TNFR1和TNFR2是TNF受体超家族中重要的两种，TNFR1通过泛素化表达，具有保守的死亡结构域基序，并且被可溶性和跨膜TNF活化，与TNFR1不同的是TNFR2缺少死亡结构域（DD domain），因此不能够像TNFR1一样诱导程序性细胞死亡的发生[11,12]。除此以外，程序性坏死也可以被Fas和TNF相关的凋亡诱导配体（TRAIL），干扰素（IFN），Toll样受体（TLR）信号等途经激活[6]，本文主要讨论TNF-α-TNFR1-RIPK1所介导的程序性坏死。
TNF-α通过TNFR1的装配结构域与TNFR1结合，并且引发了TNFR1的三聚化，实现TNFR1的激活[13]，激活后TNFR1通过死亡结构域募集（DD domain）具有同型死亡结构的TNF相关的DD蛋白（TRADD，TNFR1-associated DD protein）以及RIPK1，同时TRADD会募集TNF受体关联因子2蛋白TRAF2（TNF receptor-associated factor 2），细胞凋亡抑制蛋白1/2（cIAP1/2），其中cIAP1/2以E3泛素化形式与TRADD连接，我们将TNFR1，RIPK1，TRADD，TRAF2，cIAP1/2，TNF组成的复合体称之为复合体I（Complex I）[14,15]，而整个复合体I的对于细胞存活或者死亡的调控主要依赖于RIPK1的功能，RIPK1具有氨基末端激酶结构域（KD，amino-terminal kinase domain），中间结构域（ID，intermediate domain）和羧基末端死亡结构域（DD，carboxy-terminal death domain）这三种结构域，DD结构域能够使得RIPK1与TNFR1，TRADD与FADD的异源二聚化结合，并且促进RIPK1的同源二聚化和活化[16]。ID结构域与KD结构域相邻，在ID结构域中存在一段序列名为蛋白质同型互作基序（RHIM，protein homotypic interaction motif），介导与RIPK3的RHIM的结合，以促进坏死性凋亡和炎症中的下游信号传导[3-5]，同时在复合物I中，TRADD通过E3泛素连接募集到cIAP1和cIAP2，后者将K63泛素化链添加到RIPK1 ID结构域的K377泛素化位点上，线性泛素化装配复合物（LUBAC）通过与复合物I中的K63遍在蛋白链结合而募集，并进行RIPK1的线性（M1）泛素化，M1的泛素化位点同样存在于ID结构域上，TAK1被募集到K63泛素化链上，IKK被募集到M1泛素化链上，TAK1与活化的IKK共同介导了NF-κB通路，此通路与凋亡与坏死不同，会对细胞起到保护作用[16]。与细胞坏死最为相关的则是RIPK1的KD结构域，KD结构域S166位点的磷酸化是RIPK1活化的标志[17]，当RNA干扰（RNAi）敲低或凋亡抑制剂（IAP）拮抗剂如Smac-mimetic去除E3连接酶cIAP1和cIAP2并阻断RIPK1泛素化时，RIPK1会连同FADD以及Caspase8形成复合体II（Complex II），并介导依赖于RIPK1的细胞凋亡（RDA）[18-20]，如果将Caspase8活性抑制，如使用广谱Caspase抑制剂z-VAD，则Caspase介导的凋亡途径被抑制，在Caspase活性被抑制之后，RIPK1会募集活化RIPK3，进而RIPK3募集活化MLKL促使这三种蛋白会形成一种名为坏死小体的复合物并且介导程序性坏死的发生[4,5,21-23]。
3坏死小体的激活及功能
在复合体I向复合体II转化的过程中，RIPK1在S166位点磷酸化激活其功能形成二聚化体[16]，RIPK1的S166磷酸化激活可以被Nec-1s阻断[7]，RIPK1以及RIPK3同时具有RHIM结构域，激活的RIPK1会募集RIPK3并通过RHIM结构域相互结合，形成坏死淀粉样信号蛋白复合物[24,25]，在这个过程中，RIPK3在人源S2275或者鼠源T231 or S232位点上磷酸化活[26]。坏死小体的另外一个组成部分MLKL包含N末端四螺旋束（4HB）结构域，通过双螺旋连接子连接到C-末端假激酶结构域（PsKD，pseudokinase domain）[27]，RIPK3在小鼠MLKL中的S345或人MLKL中的T357和/或S358中对MLKL的PsKD进行磷酸化[26]，而假激酶结构域的构象转换促进人MLKL四聚化并且进一步介导细胞的死亡[28]。那么磷酸化激活后的MLKL是如何介导细胞死亡的呢？王晓东课题组在2014年对其进行了探究，他们利用了去垢剂（表面活性剂）Triton X-114的独特性能，在不同温度下经历相变，在低温（0℃）下，将Triton X-114与水溶液均匀混合，当温度升至30℃时脂溶相与水溶液分离并在离心后形成显著的分层，于是他们在不同时间点提取程序性坏死激活的HT-29细胞并将细胞提取物进行温度依赖性相分离程序，发现在6h时，p-MLKL在水相中大量表达，而恰好在6h时，脂溶相中开始出现了p-MLKL信号，在8h时，水相中p-MLKL减少，而脂溶相中增多，证明了在坏死进行的过程中p-MLKL会定位于膜结构上，通过进一步的探讨，他们发现MLKL在程序性坏死诱导发生的过程中，其N端4HB结构域与膜结构上的脂质如：磷脂酰肌醇4-磷酸（PI4P），磷脂酰肌醇（4，5）-二磷酸酯（PIP2），磷脂酰肌醇（3，4，5）-三磷酸（PIP3），心磷脂（Cardiolipin）结合，并且通过Tb3+/DPA检测到了包含上述脂质并与MLKL结合的细胞膜结构出现了膜泄露的情况，因此活化的MLKL通过N端4HB结构域与细胞膜结构上的脂质结合并且在上面打孔，最终导致了膜结构的破裂，介导程序性坏死的发生[26]。2018年Jan E.Carette团队通过对肌醇磷酸盐激酶的基因进行筛选，得到编码肌醇多磷酸多激酶（IPMK，inositol polyphosphate multikinase）以及肌醇-四磷酸1-激酶（ITPK1，inositol-tetrakisphosphate 1-kinase）的基因IPMK和ITPK1，证实了这两种基因促进了MLKL的多聚化并进一步发挥膜破裂的功能[29]，这是p-MLKL导致细胞死亡的其中一种理论，而另外一种理论则被称之为离子通道理论，定位于膜上的MLKL与TRMP7（Transient receptor potential melastatin-related 7）相结合，导致Ca2+离子的流入并最终诱导细胞死亡[30]，另外一项研究表明，MLKL复合物通过自身或与其他蛋白质共同作用，通过调节Na+通道来增加钠内流，增加了细胞质的渗透压，最终导致膜破裂31。
4细胞对于程序性坏死的自我保护
在一项最新的研究中，Fan[32]等人对细胞对于程序性坏死的自我保护进行了详细的阐述，在研究中，他们使用了MLKL敲除的HT-29细胞并且引入带HA标签的MLKL，由于活化的MLKL会定位于细胞膜的脂筏结构[31]，他们对脂筏进行了纯化，得到flotillin-1和flotillin-2这两种与细胞内吞作用相关的蛋白，经过了一系列研究，他们发现MLKL定位于膜之后会被内吞与溶酶体结合，从而实现MLKL的降解并保护细胞。另外一种理论则为ESCRT理论，在2017年Cell的一项研究中，Douglas Green及其同事揭示了运输所需的内体分选复合物（ESCRT）-III机制通过维持质膜完整性来拮抗细胞程序性坏死[33]，研究中作者诱发MLKL寡聚化并介导坏死性凋亡，激活后，MLKL定位于破膜泡的部位，在那里它募集了ESCRT-III成分，之前的研究已经证明ESCRT-III对于损伤后的膜修复是必不可少的[34]，在此过程中ESCRT-III通过主动脱落破碎的膜泡来保护坏死细胞。
5程序性坏死与神经退行性疾病
神经退行性疾病（Neurodegenerative disease）是仅次于肿瘤和心血管疾病的世界第三大疑难疾病，由于其致病机理复杂，病理模型难以构造，一直以来科研人员都在为其探索。近些年来，有一定数量的文献报道了程序性坏死与神经退行性疾病发生发展之间的联系，为早日治疗相关疾病提供了一定的理论基础，文中我们将以阿尔茨海默症，帕金森病以及肌萎缩侧索硬化症为例进行简要的阐述。
阿尔茨海默症（AD，Alzheimer's disease）是最为常见的神经退行性疾病，在临床上，AD的特征在于进行性记忆丧失，人格障碍和认知衰退[35,36]，其主要病理学特征是tau蛋白以及淀粉样蛋白-β（Aβ）的积累和神经炎症的发[37]，而Antonella Caccamo等在一项最新的研究中对阿尔茨海默症病人的大脑进行了分析后发现，与正常大脑相比，阿尔茨海默症患者大脑中与程序性坏死相关的RIPK1，MLKL显著地高表达，并通过免疫共沉淀实验证实了RIPK1与MLKL有着紧密的联系，且p-MLKL与膜标志蛋白catherin共定位，提示阿尔茨海默症患者大脑中程序性坏死的发生，而阻断程序性坏死的发生可以减少5×FAD小鼠的神经元死亡[38]，这项研究为研究程序性坏死与阿尔茨海默症之间的关系提供了一定的理论基础。此外有研究表明RIPK1抑制剂Nec-1可以改善Al处理的小鼠模型中的异常神经行为[39]，同时Nec-1也可以减轻APP/PS1小鼠模型中Aβ和tau异常导致的认知障碍[40]。
帕金森病（PD，Parkinson's disease）是一种伴随着运动性障碍，运动功能低下，休息震颤，僵硬和平衡紊乱等特点的神经退行性疾病，其特征在于黑纸纹状体中多巴胺能神经元的丧失以及被称为路易体的退化神经元中修饰的α-突触核蛋白的积累[41]，最近的研究表明PD可能与线粒体缺陷和程序性坏死的发生相关，PD患者黑质纹状体中RIPK1，RIPK3和MLKL的蛋白水平增加[42]，Nec-1抑制RIPK1从而保护PC12细胞免受6-OHDA诱导的细胞死亡，这表明RIPK1激活可能参与了PD中的多巴胺能神经元丢失的过程[43]，MPTP（1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶）诱导的PD小鼠模型的神经毒性也被Nec-1s减弱进一步印证了上述观点[42]。
肌萎缩侧索硬化症（ALS，Amyotrophic Lateral Sclerosis）是一种神经退行性疾病，其特征在于脊髓，皮质和脑干中运动神经元的退化，导致肌肉萎缩和麻痹[44]。在一项研究中，科研人员在缺乏OPTN（抑制RIPK1的泛素结合蛋白之一）的小鼠中证实了RIPK1与ALS之间的紧密联系，OPTN-/-小鼠的运动轴突数量减少，腹外侧脊髓的髓鞘形成异常，但是神经细胞的总数并未受影响。随后的一项研究发现RIP1，RIP3和MLKL在OPTN-/-小鼠和SOD1小鼠模型的脊髓中表达上调，并且在ALS死亡小鼠的脊髓中RIP3表达水平增加，且观察到了激活的RIP1和MLKL，这表明程序性坏死可能参与了ALS的病理过程。OPTN的谱系特异性缺失显示，少突胶质细胞和小胶质细胞会出现运动轴突病变的情况，与野生型少突胶质细胞相比，OPTN-/-少突胶质细胞对TNF诱导的程序性坏死更敏感，且可被Nec-1s，RIPK1 D138N突变或RIPK3缺陷所保护，于是该团队得到结论：OPTN缺陷的少突胶质细胞在TNF-α诱导的情况下更容易发生程序性坏死，进一步验证了程序性坏死在ALS中的关键作用[45]。
6总结
细胞的程序性坏死是一种近些年前才走入科研人员视野的全新程序性的细胞死亡方式，以RIPK1-RIPK3-MLKL组成的坏死小体定位于细胞膜结构并介导膜的破裂为主要特征，前文详细描述了以TNF-α为代表的程序性坏死激活的信号通路，MLKL如何一步步激活并定位于细胞膜结构，定位之后膜破裂的机理以及细胞应对程序性坏死时的自我保护机制。而神经退行性疾病在临床上有较高的发病率，但是其中绝大多数发病机理以及治疗方法未知，近些年来关于程序性坏死与神经退行性疾病之间关系的报道越来越多，文中我们以阿尔茨海默症，帕金森病，肌萎缩侧索硬化症为例，简要叙述了程序性坏死与这两种疾病发病机理之间的联系，希望通过对程序性坏死进行更多的研究从而为神经退行性疾病的发病机制提供更多的理论基础。
参考文献
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[2]Lalaoui,N.,Lindqvist,L.M.,Sandow,J.J.et al.The molecular relationships between apoptosis,autophagy and necroptosis[J].Semin Cell Dev Biol,2015,39:63-69.
[3]Zhang,D.W.et al.RIP3,an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis[J].Science,2009,325:332-336,
[4]He,S.et al.Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha[J].Cell,2009,137:1100-1111.
[5]Cho,Y.S.et al.Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation[J].Cell,2009,137:1112-1123.
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