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摘要：目的观察针灸调冲任法对输卵管炎性阻塞性不孕症大鼠TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白的影响，探讨其作用机制。方法建立模型，随机分为模型组、假手术组、常规针灸组及针灸调冲任组。模型组给予灌服生理盐水，1mL/100g，常规针灸组予常规针灸，针灸调冲任组予针灸调冲任法针灸，1次/d，连续20天。光学显微镜下观察大鼠输卵管组织形态学情况；ELISA检测大鼠血清中TGF-β1的表达；Western Blot法检测大鼠输卵管组织Smad3、Smad7蛋白表达。结果镜下观察针灸调冲任组和常规针灸组大鼠输卵管组织形态学变化较模型组明显减轻；与模型组比较，针灸调冲任组和常规针灸组可显著降低模型大鼠TGF-β1表达水平(P<0.01)、降低Smad3表达水平(P<0.05)、提高smad7表达水平(P<0.05)。结论针灸调冲任法可降低输卵管炎症后大鼠输卵管纤维化程度，改善输卵管功能,其作用机制可能与调控TGFβ1/Smads信号通路有关。
关键词：针灸；调冲任法；输卵管炎性阻塞性不孕症；TGF-β1/Smads信号通路
本文引用格式：程晓嫚,田丽颖.针灸调冲任法对输卵管炎性阻塞性不孕症大鼠TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白的影响[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(66):239-240.
Effects of Acupuncture and Moxibustion on TGF-beta 1/Smads Signaling Pathway Related Proteins in Rats with
Oviduct Obstructive Infertility
CHENG Xiao-man1,TIAN Li-ying2*
(1.Department of gynaecology,the second affiliated hospital of Anhui university of traditional Chinese medicine,Hefei Anhui;2.Department of gynaecology,the second affiliated hospital of anhui university of traditional Chinese medicine,Hefei Anhui)
ABSTRACT:Objective To observe the effect of acupuncture and moxibustion on TGF-beta 1/Smads signaling pathway related proteins in rats with oviduct obstructive infertility and explore its mechanism.Methods The model was established and randomLy divided into model group,sham operation group,routine acupuncture group and acupuncture chongchongren group.The model group was given irrigation of normal saline(1mL/100g),while the conventional acupuncture group was given routine acupuncture and moxibustion,and the acupuncture group was given acupuncture and moxibustion and moxibustion with moxibustion and moxibustion,once/d for 20 consecutive days.The histology of oviduct in rats was observed under optical microscope.The expression of TGF-beta 1 in rat serum was detected by ELISA.The protein expressions of Smad3 and Smad7 were detected by Western Blot.Results The histological changes of oviduct in the acupuncture and moxibustion tiaochongren group and the conventional acupuncture and moxibustion group were significantly reduced compared with the model group.Compared with the model group,TGF-beta 1 expression level in model rats was significantly reduced(P<0.01),Smad3 expression level was decreased(P<0.05),and smad7 expression level was increased(P<0.05)in the acupuncture and moxibustion treatment and conventional acupuncture group.Conclusion Acupuncture can reduce the degree of tubal fibrosis and improve the tubal function in rats after oviduct inflammation.The mechanism may be related to the regulation of TGF beta 1/Smads signaling pathway.
KEY WORDS:Acupuncture and moxibustion;Regulation and treatment;Oviduct inflammatory obstructive infertility;TGF-beta 1/Smads signaling pathway
0引言
输卵管炎性阻塞性不孕是指各种因素引起的输卵管阻塞或盆腔黏连，影响精卵结合或受精卵运输而导致的不孕。在女性不孕中约占30％~50％[1]。TGF-β1是目前已知的对胶原合成最直接和有效的刺激剂，激活TGF-β/Smad信号传导通路，使胶原过度沉积导致纤维化的发生发展[2]。Smads蛋白是TGF-β1配体从受体到细胞核内转导发挥致纤维化功能的重要信号分子，其中Smad3起正性调节作用,促进纤维化形成，Smad7起负反馈调节作用[3],抑制纤维化进展。本研究以输卵管炎性阻塞性不孕症大鼠为模型，通过观察针灸调理冲任法对模型大鼠TGF-β1/Smads通路中主要因子TGF-β1、Smad3及Smad7蛋白表达的影响,探讨其抗输卵管纤维化的可能作用机制。
1实验材料
1.1动物选择
选取健康清洁级Wistar雌性经产大鼠48只，雄性大鼠12只，体重200±20g，鼠龄3月龄，由安徽中药药大学医学实验动物中心提供。
1.2针具和试剂
天协牌1寸针灸针，苏州医疗用品厂有限公司清艾条。大肠埃希菌（ATCC25922）、金葡菌（ATCC25923）、溶血性链球菌（ATCC21059）按2：1：1比例用无菌生理盐水稀释，配成浓度约为3×109/mL的混合菌。菌种由安徽中医药大学微生物教研室提供、培养。美国R&D公司TGF-β1试剂盒。
1.3仪器
德国LEICA公司生物组织石蜡包埋机（BM-IX）；德国徕卡公司病理显微镜（DM3000）；德国徕卡公司病理组织切片机（VT1200S）；日本OLYMPUS公司拍摄系统（BX51）；美国Amersham公司电泳仪(EPS-301)；德国LEICA公司荧光显微镜（DM750）；美国Bio-RAD公司凝胶图像分析仪(Gel Doc XR)。
2实验方法
2.1动物分组及模型建立
适应性喂养一周后，用随机数字表法将雌鼠分为4组，假手术组12只、模型组12只、常规针灸组12只、针灸调冲任组12只。造模大鼠侧卧固定于手术台上，腹腔注射3%戊巴比妥钠（50mg/kg）麻醉，剔毛，碘伏消毒，选择肋缘过肾近脊柱侧作约0.5cm-1cm长横切口，逐层打开腹腔，假手术组开腹后直接关腹，其余3组，暴露一侧输卵管、卵巢及部分子宫，混合菌悬液0.1mL于子宫近输卵管处向输卵管方向缓慢注入，尽量避免损伤周边组织，逐层关腹，碘伏消毒切口。对侧输卵管同法处理。将大鼠放入鼠笼内，待其自然苏醒。如上法逐只造模。造模后均与雄鼠同窝，第1天开始予己烯雌酚（0.02mg/kg/d）灌胃，连续5天，饲养30天未受孕，造模成功。
2.2针灸方法
1）假手术组：开腹后直接关腹，正常喂养，灌服生理盐水（1mL/100g，1次/d）。
2）模型组：造模后，正常喂养，灌服生理盐水（1mL/100g，1次/d）。
3）常规针灸组：造模后，常规针灸关元、大赫、三阴交、次髎(参考《实验针灸学》及动物比较学方法定位)。进针约2mm，轻度捻转，得气后留针30min，期间更换艾条，1次/d，常规针灸20天，取10只进行指标检测，
4）针灸调冲任组：造模后，针灸气海、中极、关元、中注穴(参考《实验针灸学》及动物比较学方法定位)。进针约2mm，轻度捻转，得气后留针30min，期间更换艾条，1次/d，针灸20天，取10只进行指标检测。
2.3标本采集及指标检测
（1）染色光学显微镜下观察大鼠输卵管组织形态学情况
取新鲜输卵管组织，多聚甲醛固定，HE染色，光学显微镜下观察输卵管组织形态情况。
（2）ELISA检测大鼠血清中TGF-β1的表达
将大鼠血清加入预先包被大鼠TGF-β1单克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，重复上述步骤。根据OD值，计算TGF-β1含量。
（3）Western Blot法检测大鼠输卵管组织Smad3、Smad7蛋白表达
强RIPA裂解液裂解大鼠输卵管组织，提取总蛋白，电泳、转膜、封闭后，加入1:1000稀释的Smad3、Smad7单克隆抗体，室温孵育。洗涤3次。再加入二抗孵育（1:3000稀释）1 h，洗涤3次；显色、曝光、摄像。以Smad3、Smad7与内参β-actin灰度值比值作为蛋白表达量。
2.4统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件分析，所有数据先经方差齐性检验和正态性检验，数据以均数±标准差（±s)表示。
3实验结果
3.1HE染色大鼠输卵管形态学观察
假手术组（图1）：输卵管管壁组织结构不清晰，管腔有部分阻塞，少量炎性细胞浸润，纤毛坏死脱落，纤维组织增生。模型组（图2）：不仅输卵管管壁组织结构不清晰，管腔有部分阻塞，还见大量炎性细胞浸润，大片纤毛脱落，大量纤维组织增生，符合慢性炎症浸润表现。常规针灸组（图3）：输卵管管壁组织结构欠清晰，管腔轻度扩张，少量纤毛脱落，炎性细胞较模型组大量减少。针灸调冲任组（图4）：输卵管管壁组织结构尚清晰，管腔轻度扩张，少量纤毛脱落，炎性细胞较模型组大量减少。
3.2各组大鼠输卵管组织TGFβ1表达的影响
与假手术组相比，模型组TGF-β1蛋白表达明显增加；与模型组比较,针灸调冲任组、常规针灸组TGF-β1蛋白表达较模型组减少，有统计学意义(P<0.01)。
3.3各组大鼠输卵管组织smad3、smad7蛋白表达的影响
与假手术组相比，模型组smad3蛋白表达增多，smad7蛋白表达减少；与模型组比较，针灸调冲任组、常规针灸组smad3蛋白表达下降，smad7蛋白表达增高，有统计学意义(P<0.05)。
4讨论
中医学认为本病病位于少腹血室之地，病理关键是瘀阻胞络，故治疗重在活血化瘀，疏通经络，通调冲任[4]。《医宗金鉴·妇科心法要诀》云：“女子不孕之故，由伤其冲任也……”。故调理冲任治疗输卵管炎性阻塞性不孕症疗效明显。气海、关元、中极属任脉穴，任主胞胎，故任脉穴为治疗不孕症首选。大量临床研究证实，针灸不仅具有调冲任、理气血、化瘀滞、理胞络、补下元的功能[5-7]。
TGF-β1在损伤、炎症以及纤维化之间保持连接作用，是多种组织纤维化共同通路的主要介导因素，在组织损伤修复和更新过程中起重要作用,其影响贯穿伤口愈合过程的所有阶段,主要作用包括参与炎症反应和细胞外基质的积累[8]，从而促进组织纤维化。TGF-β1/Smads信号通路中TGF-β1的生物学效应主要通过细胞内的Smads蛋白介导[9]，Smad7能与R-Smad竞争性地与被激活的TGF-β受体结合，从而阻止Smad3与TGF-β受体结合及其随后的磷酸化过程，最终导致TGF-β1/Smad信号转导通路的生物学效应被抑制或减弱[10]。
本实验结果显示，模型组大鼠TGF-β1、smad3表达增加，smad7表达减少，分别予针灸调冲任法针灸、常规针灸治疗后,可提高模型大鼠smad7表达,降低TGF-β1、smad3表达。
参考文献
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