蒙药香青兰DNA条形码分子鉴定研究论文

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摘要：目的建立蒙药香青兰的ITS2基因序列的DNA条形码分子鉴定方法。方法取样品10份应用ITS2基因序列DNA条形码分子鉴定方法进行PCR扩增以及测定相关序列，在此基础上运用DNAMEAN和CodonCode Aligner17.0等软件进行相关分析。结果ITS2序列长度168bp，遗传距离（K2P）为0、G+C含量66.51%以及相应的二级结构和峰图。结论ITS2基因序列分析为香青兰DNA条形码研究奠定基础。

关键词：香青兰；ITS2序列；分子鉴定；蒙药

本文引用格式：图雅,木其尔,王秀兰,等.蒙药香青兰DNA条形码分子鉴定研究[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(61):272,274.

0引言

蒙药材香青兰为唇形科植物Dracocephalum moldavuca L.的地上部分，为特色常用蒙药。别名毕日阳古，味甘、苦，性凉、钝、轻、糙、腻，具有清胃热、泻肝火、止血，愈伤、燥协日乌素等功能，主要用于肝胃热、食物中毒、胃出血、游痛症、巴木等症[1]。在临床上与蓝盆花、五灵脂、石竹配伍治疗诸肝热症；与查干榜嘎、五灵脂、熊胆配伍治疗微扩散热、骚热、胃粘痧症，胆溢症；与红花、松石等配伍制成松石七味丸，治疗泛酸、吐苦水、胃出血、胃溃疡、胃痧症；与三子、苦参、文冠木、当药、黑云香、白云香、松香等配伍治疗急慢性黄水病、风湿散于脉道；与野玫瑰果配伍治疗牙龈红肿、腿部发紫肿胀等巴木病[2]。收载于《内蒙古蒙药材标准》（1987年版）[1]，其中只有性状鉴别和功能主治等。至今为止有关香青兰的研究尚无，本研究为香青兰深入研究及应用提供依据。

1仪器与材料

JY200C型电泳仪、JY-SPC型电泳槽、Multigene Gradient PCR仪、QUANTUM凝胶成像系统、SIGMA 3K15高速冷冻离心机、明澈-D超纯水机；ECLIPSE E100显微成像系统；离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒、Taq Master Mix(Dye)、ITS2引物、Trans5k DNA Marker、琼脂糖、其余试剂均为分析纯；实验所用香青兰2018年7月採自内蒙古通辽市奈曼旗昂乃村，由内蒙古民族大学蒙医药学院包桂花教授鉴定为Dracocephalum moldavucaL.的地上部分。

2方法与结果

2.1ITS2序列测定

根据文献[3]选择引物进行ITS2序列扩增，正向引物ITS2F5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'；反向ITS3R5‘GACGCTTCTCCAGACTACCAAT-3'，委托上海生工生物工程有限公司进行合成。

2.2总DNA提取

取样品适量研磨，用植物基因组DNA试剂盒提取总DNA，产物备用[4]。

2.3PCR扩增及电泳检测

PCR反应总体积50.0L，包含2×Es Taq MasterMix 25L,引物各2.0L（2.5mol/L），ddH2O 17L，总DNA 4.0L。扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s（进行40个循环），72℃延伸10min。同时以4.0L ddH2O作空白对照。从扩增产物中取5L反应液，经1.0％琼脂糖凝胶电泳[5-6]，其PCR产物检测结果见图1。

2.4测序

将扩增成功的PCR产物，送之北京华大测序部完成。

2.5数据处理

测序后所得序列分别利用MEGA）7.0软件处理，去除引物及两侧低质量区，获得碱基序列和峰图以及相应的二级结构图。结果见图2~3。




3结论

本研究基于ITS2序列DNA条形码技术研究香青兰，其分析结果均充分表明，ITS2序列能够准确、无误地鉴定香青兰。因此，作为DNA条形码的ITS2序列为香青兰提供新的分子鉴定方法。

DNA条形码鉴定技术可以直接从基因水平提供鉴定依据，将有助于非分类学专业工作者对蒙药用植物进行快速、准确地鉴定，是传统鉴定方法的补充和拓展，具较好的推广和应用价值。本研究结果分析了DNA条形码技术应用于蒙药用植物鉴定中被广泛关注的问题，证明了ITS2序列作为DNA条形码能够稳定、准确的鉴别香青兰，为该药的研究奠定了基础。

参考文献

[1]内蒙古自治区卫生厅.内蒙古药材标准[S].赤峰:内蒙古科学技术出版社,1987:161.
[2]蒙医学编辑委员会.中国医学百科全书·蒙医学[M].上海:上海科学技术出版社,1993:206.
[3]龚恒佩,刘祖望,陈妍月,等.松针的显微及分子鉴别研究[J].浙江大学学报,2018:300-306.
[4]刘琪,谷巍,杨兵,等.基于ITS2序列的滨海白首乌及其近缘种DNA分子鉴定[J].中草药,2018,49(24):5901-5909.
[5]冯帅,李峰,刘杨,等.基于ITS2、trn H-psb A条形码的不同产地连翘及其伪品DNA分子鉴定[J].中药材,2018,41(3):556-558.
[6]Luo K,Ma p,Yao H,et al.Study on DNA extraction method for traditional Chinese medicines[J].World Sci Technol Mod Tradit Chin Med,2012,14(2):1433-1439.

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