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摘要：目的建立鹿茸粉中提取鹿茸多肽的最佳提取工艺条件，为制剂的研发提供基础。方法 采用L9（34）正交设计法，以鹿茸多肽提取率为评价指标 , 考察加水量、提取时间、提取次数三因素对水提取工艺的影响。结果 确定以水为溶剂超声提取的最优工艺条件：用 10 倍量水， 提取 3 次，每次 30 min。乙醇提取鹿茸多肽的最优条件。结论 经过验证试验该鹿茸多肽的提取工艺稳定、简便、合理、可行。
关键词：鹿茸多肽；提取工艺；正交实验
本文引用格式：刘哲 , 张宏梅 , 王娟 , 等 . 鹿茸多肽的提取工艺研究 [J]. 世界最新医学信息文摘 ,2019,19(59):342-343.
Extraction Technology of Velvet Antler Polypeptides
LIU Zhe, ZHANG Hong-mei, WANG Juan, CUI Bai-ji
(Jilin Medical University, Jilin Jilin)
ABSTRACT: Objective This project aims to extract pilose antler polypeptide from deer antler powder.Study and optimize the extraction method,and provide the foundation reserch and development. Methods With L9 (34) orthogonal design，the velvet antler polypeptide content was as an index to optimum the extraction process, water addition,extraction times and extraction time,which had influence on the water extraction process and we studied the impact of the relative concentrations of ethanol concentration ,the solid- liquid ratio and mixing times on the ethanol precipitation process.Results The optimum technological conditions for extraction: adding 10 times amount of water into medical material,extraction 3 times and extraction 30 minutes each time. Conclusion It is stable convenient，reasonable and feasible to optimize the velvet antler polypeptide extraction process by the orthogonal experiment．
KEY WORDS: Elvet Antler Polypeptide;Extraction Process; Orthogonal Design
0引言
鹿茸为鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生绒毛的幼角，鹿茸入药距今已有两千多年的历史，史载于汉代的《神农本草经》。味甘、咸，性温，用于肾阳不足，精血亏虚，腰脊冷痛，筋骨痿软[1]。鹿茸多肽包含有丰富的表皮细胞生长因子具有能够增强机体细胞的免疫功能,可以明显的促进人胚胎软骨细胞、离体兔肋软骨细胞的细胞增值和DNA的合成,加速表皮细胞的分裂与生长，对皮肤的再生与修复起着重要的作用[2-6]。
传统的鹿茸加工技术主要是水煮，烘烤，风干相结合的方法，一方面会破坏鹿茸多肽和蛋白等热敏性成分的活性，另一方面会损失掉很多水溶性成分，所以传统的加工工艺不能充分利用鹿茸中的活性成分，从而大大地降低了鹿茸的应用价值，造成很大资源的浪费,因此研究鹿茸的提取新工艺具有非常重要的理论意义和实际应用价值。
1药品与仪器
鹿茸粉（西安天瑞生物技术有限公司，批号：20180115）；牛血清蛋白粉（合肥博美生物技术有限公司，批号：20180304）；无水硫酸铜（天津市致远化学试剂有限公司，批号：20180110）；哇哈哈纯净水（吉林哇哈哈食品有限公司，批号：20180205）；酒石酸钾（天津市致远化学试剂有限公司，批号：20180325）；碳酸钠（天津市永大化学试剂有限公司，批号：20130202）；氢氧化钠（天津市北方天医化学试剂厂，批号：20150810）；福林酚试剂（GOLDWHEAT，批号：20180303）。
SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市子华仪器有限公司）；KQ-250DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BSA623S-CW电子天平（赛多利斯）；RENCO R100旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；TD-5A离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；UV-1800可见-紫外分光光度计（日本岛津）。
2方法
2.1鹿茸多肽的含量测定
2.1.1显色剂溶液的制备
碱性铜试液：精密称取硫酸铜0.25g、酒石酸钾0.5g，加水80 mL,作为甲液；精密称取氢氧化钠10g、碳酸钠5g，加水400 mL，作为乙液。甲液、乙液合并，定容到500 mL。避光保存，临用前用0.45um滤膜滤过，即可。
2.1.2对照品溶液的制备
取牛血清白蛋白10 mg，精密称定，放入100 mL容量瓶中，加水溶解、稀释定容,得浓度为0.10mg/mL的对照品溶液。
2.1.3供试品溶液的制备
取提取液0.2 mL转移至50 mL量瓶中，加水稀释、定容，即得提取液样品。
2.1.4检测波长的确定
采用福林酚法测定其最大吸收波长，对照品溶液、供试品溶液于400~700nm区间扫描，对照品与供试品均在650nm处有最大吸收，所以本实验选择650nm为测定波长。
2.1.5标准曲线的制备
精密量取“2.1.2”项下对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别转移到具塞试管中，加水补至1.0 mL，分别加碱性铜试液5 mL，摇匀，室温下放置10min，再依次加入福林酚试剂0.5 mL，摇匀，室温下放置30min，采用紫外-可见分光光度法，在650nm的波长处测定吸光度。以0管作为空白，以各供试品溶液浓度与其相对应的吸光度计算，结果吸光度分别为0.355、0.380、0.458、0.545、0.626、0.702，进行线性回归分析，得到的回归方程为：Y=3.9518X+0.3068，r=0.9992。说明蛋白质含量在1-100g/mL范围内，线性关系良好，标准曲线见图1。
2.2正交实验提取鹿茸多肽
采用L9（34）因素水平表进行正交实验。取鹿茸粉末10g，精密称定，置于锥形瓶中，以水做溶剂进行超声提取，提取液放冷至室温，8000 r/min离心10 min，取上清液，记录上清液体积，按“2.1”项方法进行鹿茸多肽的含量测定，计算多肽含量提取率，以提取率的多少作为评价指标进行正交实验的评分依据，因素水平表见表1，正交实验结果及方差分析见表2、3。
从表2的结果中可以看出，影响多肽提取率的因素按其影响程度的大小分别为加水量（A）﹥提取次数（C）﹥提取时间（B），结合各因素的K值，得出最佳提取工艺条件为A1B3C3，即加水量为10倍，提取时间30min，提取3次。
从表3中可以看出，加水量对鹿茸多肽提取率有显著性影响。因为随着水量的增大，水中多肽的含量也逐渐增大，直至趋于饱和状态。所以在加水量为10倍的时候，多肽的提取率最大。而提取时间和提取次数对多肽提取率影响较小。
2.3验证实验
根据“2.2”项中优化的最佳提取工艺方法，进行三批样品的验证性实验，采用“2.1”项的方法进行提取率的测定，结果三次平行实验得到多肽提取率分别为17.3%、17.5%、17.8%，平均值为17.4%。由结果可知，本工艺重现性良好。
3讨论
通过正交实验对影响鹿茸多肽提取因素的筛选，最终确定以水为溶剂超声辅助提取最佳工艺为加10倍量的水，提取30min，提取3次作为最佳的提取工艺。本研究同时考察了乙醇超声提取和酶降解的提取工艺，对比发现，乙醇提取过程中耗时较长，而酶降解提取工艺的温度和pH要求相对来说比较高，且提取率也没有显著性增高，所以本研究最终采用了以水作为提取溶剂，超声辅助的提取工艺，使用无机溶剂做提取剂，可有效避免有机溶剂对人身体健康的损害和环境的污染，同时也降低了生产成本，适合鹿茸的大规模工业生产，而且也适合其他天然药物的提取。超声水提取多肽的方法，提取时间较短，操作简单，成本低廉，安全性高。考虑到实际生产情况，超声水提取多肽的方法更实用。
参考文献
[1]中华人民共和国国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京化学工业出版社,2015.
[2]潘风光,孙威,周玉,等.梅花鹿鹿茸活性多肽的提取及免疫功效的初步研究[J].中国生物制品学杂志,2007,20(09):669-673.
[3]郭颖杰.鹿茸多肽对骨、软骨细胞增殖的实验研究[J].中医生化药物杂志,2000,19(2):74.
[4]周秋丽,郭颖杰,等.鹿茸多肽对实验性骨折的治疗作用及机理研究[J].白求恩医科大学学报,2003,25(5):586.
[5]江瑞祥,高锦明,叶大同,等.鹿茸表皮生长因子[J].动物学报,2000,33(24):301.
[6]HuoY.The differential expression of NGPS-like sub-stance from fresh pilose anter of cervus Nippon temminck[J].Biorned Sci Insulin,1997,33:541
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