SCI论文（www.lunwensci.com）:
摘要：目的基于网络药理学筛选天麻抗心肌缺血的分子机制研究。方法借助化学专业数据库获取天麻活性成分，基于CTD（Comparative Toxicogenomics Database）筛选心肌缺血靶点，基于DAVID数据库对靶点进行生物过程(biological process，BP)、细胞成分(cellular component，CC)以及分子功能(molecular function，MF)分析，借助STRING软件对心肌缺血靶点进行相互作用分析，通过分子对接（SYBYL2.1，Tripos）将天麻活性成分与白细胞介素-6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF），血管内皮生长因子A（VEGFA），白细胞介素1β（IL1B）进行能量匹配。结果天麻活性成分11个，涉及149条（P<0.01）通路分析，心血管相关通路24条，包括TNF信号通路、PPAR信号通路、PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、Ras信号通路等，TNF信号通路为最显著信号通路。通过分子对接发现天麻11个活性成分与TNF，IL1B，VEGFA和IL6有较好的结合。进一步明确天麻是通过多成分作用在同一靶点或单成分调节多个靶点发挥抗心肌缺血的作用。结论从分子层面筛选出天麻抗心肌缺血的活性成分及关键靶点，为临床有效应用天麻提供理论依据。
关键词：天麻；心肌缺血；分子对接；网络药理学
本文引用格式：韩彩瑶,邓万娟,李专,等.基于网络药理学筛选天麻抗心肌缺血的分子机制研究[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(59):25-28.
The Study of Screening the Molecular Echanism of Gastrodia elata Bl Treatment Myocardial Ischemia Based on Network Pharmacology
HAN Cai-yao,DENG Wan-juan,LI Zhuan,ZHANG Peng-fei,YANG Xin*
(Guizhou university of traditional Chinese medicine,Guizhou Guiyang)
ABSTRACT:Objective To screen the molecular mechanism of Gastrodia elata BI treatment myocardial ischemia based on network pharmacology.Methods The active ingredients of Gastrodia elata BI were obtained by using chemical database,The screening of myocardial ischemia targets based on the Comparative Toxicogenomics Database,and the analysis of biological process,cellular component and molecular functionof targets based on the DAVID Database,and the interaction analysis of myocardial ischemia targets with the help of STRING software,the active components of Gastrodia elata match IL6,TNF,VEGFA and IL1βof energy by molecular docking(SYBYL2.1,Tripos).Results There are 11 active components of Gastrodia elata BI,involving 149(P<0.01)pathways and 24 cardiovascular related pathways,and including TNF signal pathway,PPAR signal pathway,PI3K-Akt signal pathway,p53 signal pathway,Ras signal pathway and so on,TNF signaling pathway is the most significant signaling pathway.By molecular docking,11 active components of Gastrodia elata Bl were found to bind well to TNF,IL1B,VEGFA and IL6.It is further clarified that Gastrodia elata Bl plays an anti-myocardial ischemic role by regulating multiple targets at the same target or single component.Conclusion The active ingredients and key targets of Gastrodia elata Bl against myocardial ischemia were screened from molecular level,which provided theoretical basis for the effective clinical application of Gastrodia elata Bl.
KEY WORDS:Gastrodia elata Bl;Myocardial ischemia;Molecular docking;Network Pharmacology
0引言
目前，心肌缺血的患病率呈逐年上升的趋势，该病多发于中老年人。心血管疾病包括心肌梗死，不稳定型心绞痛，稳定型心绞痛和心源性猝死等等[1]。近年来心血管疾病的发病率、病死率在全球范围内逐年上升，而其中急性心肌梗死及冠状动脉粥样硬化占绝大多数。临床上预防心肌缺血的方法很多，如瑞芬太尼预处理，远程缺血预处理等[2]。中药及天然产物具有安全、对靶器官损伤较小、可操作性强等优点，在临床上广泛应用于心血管疾病[3]。但是心肌缺血治疗的中药尚未开发完全，尤其是贵州的道地药材，面临心血管方面的难题，本研究选择贵州道地药材天麻为切入点，为其产品开发提供理论依据。
随着科学技术的发展，网络药理学、计算机辅助药物设计为中医药的发展做出贡献，由于中药活性成分多、调节的靶点多、药理作用多等特点，使常规实验评价化学成分活性费时、费力。网络药理学和计算虚拟平台为化合物的筛选提供了较好的补充和替代手段[4-6]。
天麻为贵州道地药材之一，化学成分诸多，天麻的化学成分主要有天麻苷（天麻素）、天麻苷元、香草醇、柠檬酸、天麻醚苷等[7]。天麻药理作用诸多，医用价值较高，研究者不断积极开发和利用，让其医用价值充分发挥出来。天麻在心血管疾病中的应用研究成果较多，主要围绕天麻注射液、天麻单体、复方展开研究[8-10]。本研究通过计算机辅助药物设计对天麻活性成分与心肌缺血关键靶标蛋白进行模拟研究，从活性成分、调节的靶点为切入点，通过分子对接筛选天麻在心血管疾病中发挥作用的活性分子及调节的靶标蛋白，为临床上天麻配伍、复方用药提供理论依据。
1材料与方法
1.1数据库与软件
RCSB PDB(http://www.rcsb.org/pdb)；PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库；化学专业数据库（http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）STRING（https://string-db.org/）；Cytoscape 3.5.1软件（http：//www.cytoscape.org）；SYBYL
2.1.1软件(美国Tripos公司)；Commparative Toxicogenomics Database：（http://ctdbase.org/）；软件运行于Windows操作系统平台下。处理器为Inter(R)Core(TM)i5-7500CPU@3.4GHz，64位操作系统，使用的相关软件已授权或开源软件。
1.2天麻活性成分筛选及类药性分析
通过化学专业数据库（http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）获取天麻活性成分。进入中药与化学成分数据库，输入天麻进行检索，去除重复。3D结构下载于PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库。采用SYBYL2.1.1对小分子进一步优化。
1.3心肌缺血靶点的获取
通过CTD（Comparative Toxicogenomics Database，比较毒物基因组学数据库）查找心肌缺血的潜在靶标基因，以“Myocardial Ischemia”为关键词检索心肌缺血的相关靶点，选择已经有实验验证的“M（marker/mechanism）”或“T（therapeutic）”的靶标，统计潜在靶标基因的数目。
1.4心肌缺血生物功能分析
靶点GO功能分析基于DAVID 6.8（DAVID 6.8，https://david.ncifcrf.gov/）在线分析，将65个靶点导入DAVID数据库，点击限定物种为人源，设定阈值P<0.01，GO注释分析包含，即细胞组分(cellular component，CC)、生物过程(biological process，BP)以及分子功能(molecular function，MF)。
1.5靶标通路分析及ggplot2构建网络模型
DAVID为生物信息学数据库，包括大量基因和蛋白的生物信息。可以用于靶标功能、疾病分析和通路分析等。打开DAVID，将潜在靶标基因号输入到Enter Gene List中，在Annotation Summary Results界面中选择Pathways，点击Functional Annotation Chart，得到靶标蛋白所参与的所有途径，筛选出靶标蛋白显著参与的途径（P≤0.01），通过Rstudio中的ggplot2绘制，包括通路名称、富集分析的P值、Q值和Rich factor等。Rich factor通过计算所得，数值越大表示富集程度越大。
1.6hub靶点筛选
基于Cytoscape3.5.1软件中的Cytohubba模块[11]，该模块提供12种拓扑分析方法，包括常见的Degree（度），最大邻居组件（Maximum neighborhood component），边过滤成分（Edge Percolated component），紧密度（closeness），瓶颈值（bottleneck，BN），发散性（radiality），偏心度（EcCentricity），最大邻居连通密度（Density of Maximum Neighborhood Component）等，通过cytoHubba中的epc，degree，mcc，stree四种算法输出hub基因[11-12]。
1.7分子对接分析
从蛋白质晶体结构数据库RCSB(http://www.rcsb.org/pdb)获取3D晶体结构[13]，白细胞介素-6（PDBID：1ALU）：晶体结构在1.9Å的解象下以X衍射的方法获得；肿瘤坏死因子（PDBID：2AZ5）：晶体结构在2.1Å的解象下以X衍射的方法获得；血管内皮生长因子A（PDBID：3BDY）：晶体结构在2.6Å的解象下以X衍射的方法获得；白细胞介素1β（PDBID：1RWN）：晶体结构在2.0Å的解象下以X衍射的方法获得。采用药物分子设计模拟Sybyl 2.1.1软件的Surflex-Dock模块完成分子对接研究[11]。利用Surflex-Dock分子对接模块的Total-Score打分函数对天麻化学成分与心肌缺血靶标蛋白相互作用进行评价，Total-Score值愈大，说明天麻化学成分与心肌缺血靶标蛋白质的匹配结合作用越好[14-15]。
2结果
2.1天麻化学成分
天麻活性成分11个，分别为：4,4’-二羟基二苯甲烷、3,4-二羟基苯甲醛、丁二酸、天麻素、天麻醚苷、对-羟苄基乙醚、对-羟基苯甲醛、胡萝卜苷、枸橼酸、香草醇、4-(4’-羟苄氧基)苄基甲醚。
2.2心肌缺血靶点通路分析
基于CTD共是筛选出心肌缺血靶标178个，涉及149条（P<0.01）通路分析，心血管相关通路24条，包括TNF信号通路、PPAR信号通路、PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、Ras信号通路等，TNF信号通路为最显著信号通路，见图1。
2.3GO注释分析
心肌缺血178个靶标蛋白，在生物过程中，178个靶点主要参与基因表达的正调控（positive regulation of gene expression）、血压调节（regulation of blood pressure）、血管生成的正调节（positive regulation of angiogenesis）等；178个靶点主要存在胞外空间（extracellular space）、线粒体（mitochondrion）、髓鞘（myelin sheath）等。分子功能上，178个靶点主要参与蛋白质结合（protein binding）、细胞因子活性（cytokine activity）、酶结合（enzyme binding）等。
2.4Hub靶点分析
178个心肌缺血靶点通过STRING进行相互作用分析，基于Cytoscape3.5.1中的cytoHubba中的EPC，MNC，MCC，STREE四种算法输出前10个hub基因（图3），采用FunRich 3.0软件绘制心肌缺血hub靶点的韦恩图，通过取交集的方法获取4个hub靶点：白细胞介素-6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF），血管内皮生长因子A（VEGFA），白细胞介素1β（IL1B），关键靶标的基本信息详见表2。
2.5分子对接分析
基于SYBYL2.1对天麻12个化学成分与白细胞介素-6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF），血管内皮生长因子A（VEGFA），白细胞介素1β（IL1B）进行分子对接。结果以total score>5为阈值，筛选天麻关键化学成分及靶标蛋白。11个天麻活性成分与靶标蛋白结合的强弱为：TNF>IL1B>VEGFA>IL6（表3）。4-(4’-羟苄氧基)苄基甲醚、天麻素、天麻醚苷与VEGFA，IL1B有较好的结合；胡萝卜苷与TNF有较好的结合；枸橼酸与IL6、IL1B有较好的结合。
3讨论
活血化瘀法是中医药治疗心肌缺血的重要治法之一，中医治疗注重功能的恢复，以及新平衡的建立。中药是通过多途径、多靶点、多成分调节机体阴阳失调，使机体恢复平衡状态。本研究基于天麻的化学成分，通过计算机辅助药物设计对天麻中的化合物及其与心肌缺血关键靶标蛋白进行模拟研究，结果发现天麻11个活性成分与TNF，IL1B，VEGFA和IL6有较好的结合。其中4-(4’-羟苄氧基)苄基甲醚、天麻素、天麻醚苷与VEGFA，IL1B有较好的结合；胡萝卜苷与TNF有较好的结合；枸橼酸与IL6、IL1B有较好的结合。白细胞介素1β（IL1β）为急性炎性因子，在心肌缺血早期产生，主要在炎性级联反应上游发挥作用，诱导血管内皮细胞表达黏附分子，使炎症反应加重[23]；肿瘤坏死因子（TNF）在炎性反应、细胞免疫、肿瘤免疫等多种生理和病理过程中发挥关键作用[18]；白细胞介素-6(IL-6)是一种炎症因子，可引起炎症与氧化应激,其表达与动脉粥样硬化、心肌梗死后心室重构、心肌缺血再灌注损伤、心肌炎、高血压病、心房颤动、糖尿病心肌病等心血管系统疾病相关，是这些疾病病理过程发生发展的关键危险因素[17]；血管内皮生长因子A（VEGFA）具有增加微、小静脉血管的通透性、促使血管内皮细胞分裂增殖及诱导血管生成再生等作用[20]。进一步明确天麻是通过多成分作用在同一靶点或单成分调节多个靶点发挥抗心肌缺血的作用。
天麻是贵州道地药材，天麻可以食用，也可以药用，临床应用广泛。目前，在心血管疾病方面已经开发了天麻杜仲胶囊、天麻钩藤颗粒、天麻注射液滴丸等[25-27]。而且也以基地建设为基础进行产业化开发。本研究将计算机理论知识运用到科研上，加强学科之间的相互渗透、融合。筛选出天麻保护心肌缺血的分子机制，为其药理作用的开发和应用提供理论依据。通过整合数据库建立天麻-虚拟筛选平台，为天麻的药理活性筛选提供快速、简单的操作方法，为贵州天麻心血管方面的产品开发提供理论依据。
参考文献
[1]刘旭,程艳芹,崔晓博,等.中药川芎心肌缺血保护作用的谱效学研究[J].中国药业,2016,25(15):9-12.
[2]杨禹晗,陈超英,袁占鹏,等.玉竹提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞线粒体损伤及凋亡的保护作用[J].中国实验方剂学杂志,2018,24(16):136-140.
[3]丁岩,游丽萍,蒋嘉明,等.三七茎叶总皂苷对心肌缺血再灌注损伤保护作用研究[J].世界科学技术-中医药现代化,2018,20(04):541-546.
[4]Hopkins A L.Network pharmacology[J].Nature Biotechnology,2007,25(10):1110-1111.
[5]刘艾林,杜冠华.计算机药物筛选方法探讨[J].计算机与应用化学2002,19(1):32-34.
[6]宋阔魁,毕天,展晓日,等.网络药理学指导下的中药有效成分发现策略[J].世界科学技术—中医药现代化,2014,16(1):27-31.
[7]王亚威,李志峰,何明珍,等.天麻的化学成分研究[J].中草药,2013,44(21):2974-2976.
[8]齐学军,刘金敏.穴位注射天麻素注射液治疗后循环缺血性眩晕的疗效观察[J].中西药结合心脑血管病杂志,2010,8(8):937-938.
[9]魏征人,刘国梁,梁蕾,等.天麻对病毒性心肌炎实验小鼠心肌细胞凋亡的影响[J].临床儿科杂志,2008,26(5):392-394.
[10]宋阳,李珊,李洁,等.天麻素对离体蟾蜍心脏活动影响的实验研究[J].中国民族民间医药,2012,2l(4):46-47.
[11]Shannon P,Markiel A,Ozier O,et al.Cytoscape:A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks[J].GenomeR es,2003,13(11):2498-2504.
[12]唐羽,李敏.基于Cytoscape的蛋白质网络可视化聚类分析插件[J].生物信息学,2014,1(7):39-43.
[13]Berman HM,Westbrook J,Feng Z,et al.The Protein Data Bank.Nucleic Acids Res.2000,28(1):235-242.
[14]林桂源,姚华聪,郑细娜,等.基于分子对接技术的常用降糖中药有效成分虚拟筛选[J].中国实验方剂学杂志,2015,21(15):202-206.
[15]Spitzer R,Jain A.N.Surflex-Dock:docking benchmarks and real-world application[J].J Comput AidedMol Des,2012,26(6):687-699.
[16]Abeywardena Y,Leifert R,Warnes E,et al.Cardiovascular biology of interleukin-6[J].Curr Pharm Des,2009,15(15):1809-1821.
[17]Tanaka Y;Martin Mola E.IL-6 targeting compared to TNF targeting in rheumatoid arthritis:studies of olokizumab,sarilumab and sirukumab[J].Ann Rheum Dis,2014,73(9):1595-1597.
[18]江海龙,王宁远,陆一鸣.肿瘤坏死因子受体选择性拮抗剂的研究进展[J].药学实践杂志,2015,33(5):392-395.
[19]Feldmann M,Brennan FM,Foxwell BM,et al.The role of TNF alpha and IL-1 in rheumatoid arthritis[J].Curr Dir Autoimmun,2001,3(1):188-199.
[20]滕清蕾,高建芝,侯慧芳,等.异丙酚对小儿围手术期肿瘤坏死因子-a、白细胞介素-10的影响[J].实用儿科临床杂志,2006,21(1):51-52.
[21]王骏,励建安,金挺剑,等.心肌缺血日负荷对新西兰兔血管内皮生长因子表达的影响[J].中国康复医学杂志,2005,20(3):165-167.
[22]孙馏瑛,徐鹏霄.血管内皮生长因子的研究和应用进展[J].解剖科学进展,2003,9(4):361-363.
[23]冉擘力,司良毅,何国祥.白介素-1β预处理对心肌细胞粘附分子表达的影响[J].解放军医学杂志,2002,27(2):155-156.
[24]司良毅,陈运贞.缺血再灌注心肌白介素-1表达和N-乙酰半胱氨酸对损伤影响的观察[J].第三军医大学学报,2002,24(5):581-584.
[25]聂晶,杜亮,黄燮南,等.天麻素对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].华西药学杂志,2010,25(4):423-425.
[26]陈湖海,黄涛,孙慧伶,等.天麻素治疗冠心病心绞痛的临床效果[J].中国医药导报,2016,13(14):126-128.
[27]陶平德,范荣兰.天麻素注射液治疗脑外伤性眩晕临床研究[J].中医学报,2016,31(7):1056-1058.
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