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摘 要：目的 建立高效液相色谱法测定氨甲苯酸注射液中氨甲苯酸含量的方法。方法 采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱，0.05 mol•L-1 磷酸二氢钾溶液（用 1 mol•L-1 氢氧化钾调节 pH 值至 6.0）- 甲醇（95:5）为流动相，226 nm 为检测波长。结果 氨甲苯酸在 20.26 µg•ml-1-405.2 µg•ml-1 的浓度范围内线性关系良好（r=0.99997）； 平均回收率为 100.25%，RSD 为 0.46%（n =9）。结论 该方法准确、可靠、简便，专属性强，可用于氨甲苯酸注射液的质量控制。
关键词： 高效液相色谱法；氨甲苯酸；含量测定
本文引用格式：庄文君, 钱春艳.HPLC 法测定氨甲苯酸注射液中氨甲苯酸的含量[J]. 世界最新医学信息文摘,2018,18(73):99+101.
0引言
氨甲苯酸是促凝血药，临床用于因原发性纤维蛋白溶解过度所引起的出血，包括急性和慢性、局部性或全身性的高纤溶出血。氨甲苯酸注射液执行标准为中华人民共和国药典 1995 年版二部 [1]，含量测定采用氢氧化钠滴定液滴定的容量分析方法测定，操作较为繁琐、专属性差。本文参考相关文献 [2-4]，结合氨甲苯酸 PKa 特性，采用 HPLC 法测定氨甲苯酸注射液中氨甲苯酸的含量，结果准确可靠、重现性好、专属性强。
1仪器与试药
1.1仪器。
上海天美UV2300 紫外- 可见分光光度计; 梅特勒- 托利多 XS105 电子天平；Alliance Waters e2695-UV2489 自动进样高效液相色谱仪 Empower2 工作站。
1.2试药。
氨甲苯酸对照品（ 系为自制工作标准品含量99.80%）甲醇为色谱纯、水为注射用水、其它试剂为分析纯。 供 试 品： 氨 甲 苯 酸 注 射 液 三 批（ 样 品 A， 批 号15042001； 样 品 B， 批 号 15042002； 样 品 C， 批 号15042101）。
2方法与结果
2.1色谱条件与系统适用性试验，色谱条件：WelchromC18 色谱柱（4.6×250 mm 5.0 um）0.05mol•L-1 磷酸二氢钾溶液（用 1 mol•L-1 氢氧化钾调节 pH 值至 6.0）- 甲醇（95:5） 作为流动相，检测波长为 226 nm，流速为 1.0 mL•min-1， 进样量 10 µl，柱温 30℃。
系统适用性试验：精密量取“2.2 溶液制备”项下对照品溶液、空白溶液各 10 ul，分别注入液相色谱仪记录色谱图，辅料对氨甲苯酸含量测定无影响，理论塔板数（按氨甲苯酸计）6012。
2.2溶液制备。
对照品溶液：精密称取氨甲苯酸对照品适量加流动相制成每 1 mL 约含 100 µg 的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液：精密量取氨甲苯酸注射液适量加流动相制成每 1 mL 约含 100 µg 的溶液，作为供试品溶液。
空白溶液：按工艺处方配制除不含氨甲苯酸的空白样品， 再按供试品溶液配制步骤制成空白溶液。
2.3专属性试验。
取氨甲苯酸的破坏性样品：碱破坏样品（用 1 mol•L-1 氢氧化钠溶液水浴 1 h）、酸破坏样品（用 1mol•L-1 盐酸溶液水浴 1 h）、氧化破坏样品（用 30% 的过氧化氢溶液水浴 1 h）、光照破坏样品（在 4000l× 光照强度下光照 24 h），由于氨甲苯酸注射液为水溶液，产品采用高温灭菌的方式进行最终处理故未进行高温、高湿破坏，量取上述样品分别注入液相色谱仪记录色谱图，结果显示，各降解产物峰与氨甲苯酸峰之间均可以达到较好的分离。其中光照破坏样品、碱破坏样品、酸破坏样品降解产物较少，氧化破坏样品出现较多降解产物，氨甲苯酸几乎全部被氧化破坏。
2.4线性关系。
精密称取氨甲苯酸对照品适量，加流动相溶解稀释制备成约 1.0 mg•ml-1（101.50 mg 至 100 mL）浓度的溶液，再加流动相分别稀释成约含 0.02 mg•ml-1（2 → 100 mL）、0.05 mg•ml-1（5 → 100 mL）、0.1 mg•ml-1（5 → 50mL）、0.2 mg•ml-1（5 → 25 mL）、0.4 mg•ml-1（10 → 25mL），照 2.1 色谱条件进行测定，记录色谱图，峰面积分别为，712436、1778313、3571883、7029395、13899791。以氨甲苯酸峰面积和氨甲苯酸溶液浓度绘制线性标准曲线，线性回归方程为：Y=34663X+60271，r=0.99997；结果表明在 20µg•mL-1-400 µg•mL-1（20.26µg•mL-1-405.2 µg•mL-1）范围内氨甲苯酸峰面积与氨甲苯酸溶液浓度呈现良好线性关系。
2.5准确度试验。
精密称取氨甲苯酸对照品适量，用“2.2 溶液制备”项下空白溶液作为稀释液，制成相当于主药浓度的 80%、100%、120% 的药液，按“2.10 样品测定”方法测定， 外标法计算回收率。平均回收率为 100.25%，RSD 为 0.46%。
2.6精密度试验。
精密量取“2.2 溶液制备”项下供试品溶液10 μl，注入液相色谱仪，重复进样 6 次，记录色谱图，峰面积分 别 为：3568924、3556878、3560179、3572896、3575874、3559869；平均峰面积为 3565770，RSD 为 0.22%（n =6）。
2.7溶液稳定性。
取“2.2 溶液制备”项下供试品溶液进行稳定性考察，分别在 1 h、2 h、4 h、6 h、12 h 时进样， 分别每次进样 10μl，记录色谱图 [5]，色谱峰面积分别为：3559869、3551246、3574028、3567805、3571024；并与 0h时峰面积3568924 对比，平均峰面积为3565483，RSD 为0.24%（n =6），考察结果表明本制备方法下的溶液在 12 h 以内溶液较为稳定性。
2.8定量限。
取线性关系考察项下的 0.02 mg•ml-1（2 → 100mL）溶液进行稀释测定，当进样 10μl，氨甲苯酸浓度为 0.1µg•mL-1 时信噪比 S/N 约为 10:1，定量限为 0.1 µg•mL-1×10μl=1.0 ng。
2.9耐用性。
适当调整实验条件，使用不同品牌色谱柱 ，PhenexemC18 色 谱 柱 （4.6×250 mm 5.0 um） 与
WelchromC18 色谱柱（4.6×250 mm5.0 um）；改变柱温的温度设定，分别设定 35℃、25℃；调整流动相流速，流速分别为 1.1 mL/min、0.9 mL/min；逐一进行试验，试验结果均对实验条件无不良影响。2.10样品测定。精密称取氨甲苯酸对照品适量加流动相制成每 1 mL 约含 100 µg 的溶液，作为对照品溶液。分别精密量取氨甲苯酸注射液样品 A、样品 B、样品 C，适量加流动相制成每 1 mL 约含 100 µg 的溶液，作为供试品溶液。按“2.1 色谱条件与系统适用性试验”的条件，采用外标法进行含量测定，同时按现行标准方法进行含量测定。测定结果对比如表 1。
3讨论
3.1检测波长的选择。
取氨甲苯酸工作标准品适量（浓度 0.02 mg•mL-1）加流动相稀释，用流动相做空白对照，在 210- 250 nm 波长范围内扫描，在 226 nm 处有最大吸收，故选择226 nm 为检测波长。
3.2流动相与溶剂的选 择。
氨甲苯酸 PKa1=3.77，PKa2=9.57[2] 为确保氨甲苯酸在溶液状态选择 PH 值在 5.8 至6.5 之间的缓冲盐较好，故流动相与溶剂均选择 0.05 mol•L-1 磷酸二氢钾溶液（用 1 mol•L-1 氢氧化钾调节 pH 值至 6.0）- 甲醇（95:5）。
氨甲苯酸注射液的现行质量标准为中华人民共和国药典1995 年版二部，采用容量分析法测定含量，操作较为繁琐、专属性差，并且滴定终点之前需考虑颜色变化，易引起操作误差。本文采用 HPLC 法测定氨甲苯酸注射液中氨甲苯酸的含量，方法快速、准确、专属性强，结果可靠。
参考文献：
[1]国家药典委员会.中国药典: 二部[S].化学工业出版社,1995:738-739.
[2]武振卿, 何云生. 两性离子有机药物的离解常数 [J]. 沈阳药学院学报 ,1988,5(3):225-231.
[3]庄航 , 葛雪松, 卓静, 等.HPLC 法测定氨甲苯酸注射液中氨甲苯酸的含量[J]. 中国药师,2010,13(6):895-896.
[4]郭旭光 , 郭兴辉.HPLC 法测定氨甲苯酸注射液的含量及有关物质[J]. 安徽医药 ,2012,16(8):1084-1086.
[5]庄文君, 毛向阳. 氨基己酸注射液中氨基己酸的含量测定 [J]. 抗感染药学,2016,13(3):506-509.
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