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摘要：目的探讨吡非尼酮对UUO大鼠肾间质纤维化组织中GSK3-β蛋白、Wnt/β-catenin通路的影响及其对肾间质纤维化的作用。方法将Wistar雄性大鼠72只，随机分为3组：假手术组、UUO组以0.9%Nacl2mL/d灌胃，吡非尼酮组在UUO组的基础上以吡非尼酮250mg/kg溶解在0.9%Nacl2mL/d灌胃。各组大鼠于术后第3，7，14天分别处死8只。结果在各时间点，与假手术组相比较，UUO模型组肾小管间质损伤和纤维化程度明显，GSK3-β蛋白、β-catenin明显表达增多，差异具有统计学意义(P<0.05)；且随着梗阻时间延长(3、7、14天)，UUO模型组大鼠的GSK3-β蛋白及β-catenin的表达逐渐增加。与UUO组相比吡非尼酮组大鼠肾间质组织中GSK3-β蛋白，β-catenin表达水平显著降低(P<0.05)。结论吡非尼酮能够通过下调GSK3-β蛋白的表达进而调节Wnt/β-catenin信号通路抑制β-catenin的产生延缓肾间质纤维化的发生及发展，可能为肾纤维化的临床治疗及研究提供新的作用靶点及理论依据。
关键词：肾脏纤维化；吡非尼酮；GSK3-β蛋白；β-catenin
本文引用格式：张振浩,康晓明,聂晶,等.吡非尼酮对UUO大鼠肾组织中GSK3β蛋白、WNT/β-catenin通路的影响[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(80):224-225,231.
0引言
肾脏纤维化(Ｒenal interstitial fibrosis，ＲIF)是各种慢性肾脏疾病(Chronic kidney diseases，CKD)进展为终末期肾衰竭(End-stage renal disease ESＲD)的病理损伤表现，最终发展为肾脏纤维化。目前主要特征的病理改变有肾小球硬化、肾小管萎缩和扩张、肾小管间质炎症和纤维化、肾小球和肾小管周为毛细血管减少。[1]现目前已知的肾间质纤维的机制中肾小管上皮细胞转分化(eqithelial to mesenchymal transition EMT)占有较重要的地位，EMT的主要特征性表现：上皮细胞标志如E一钙黏蛋白(E—cadherin)的丢失，间充质标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白等的重新获得。[2]目前对EMT在肾间质纤维化中的作用机制研究不全面，仍需要我们进一步探索与研究，因此本课题选择继续研究EMT在肾间质纤维化中的作用。随着社会经济的迅速发展，生活水平的提高，人类疾病种类发生着变化，慢性肾脏病（CKD）具有患病率高，医疗费用巨大、目前已成为影响我国国民健康的主要疾病，严重影响着我国国民的生活质量[3]。张路霞[4]等报道我国CKD的患病发病特点还表现出20岁-30岁人群患病人数增多，最小不到10岁的年轻化发病趋势。近几年临床统计研究发现，儿童原发性肾病综合征及继发性肾脏损害性疾病发病率逐年上升，严重影响了我国儿童及青少年的身体健康。随着社会经济的飞速发展及生活水平的提高，儿童肥胖症的发病率也逐年升高，部分专家认为这也是儿童肾病发病率逐年升高的另一重要因素。近期研究表明，慢性肾脏病发生发展过程中，肾小管的损伤程度与CKD预后密切相关[5]，因此研究肾间质纤维化（RIF）的发病机制，研发抗肾间质纤维化的药物，对CKD的控制及治疗具有重要的临床意义[6]。
1材料与方法
1.1实验动物及试剂
由佳木斯大学动物实验中心提供的健康有活力的清洁级雄性Wistar大鼠72只，体重(130±10)g；吡非尼酮（艾思瑞）100mg/粒(佳木斯大学附属第一医院)，兔抗大鼠GSK3-β蛋白、β-catenin蛋白(购买于武汉博士德生物工程有限公司)、DAB显色试剂盒、免疫组化试剂盒(购买于武汉博士德生物工程有限公司)。
1.2方法
1.2.1实验步骤
清洁Wistar大鼠72只，适应喂养一周后，将其随机均分为3组：UUO组、假手术组、吡非尼酮组。UUO组及吡非尼酮组的大鼠：麻醉：10%水合氯醛0.3~0.4mL/100g腹腔内注射，将大鼠固定(俯卧位)，备皮，碘伏消毒，戴无菌手套，铺无菌洞巾，在大鼠背部，左侧肋腰点下、脊柱左侧作一纵向切口，约2.0cm长，逐层切开皮肤、筋膜、肌肉及腹膜，见肾脏位于脊柱旁，用玻璃分针轻轻剥离肾下极部分包膜及肾蒂处包膜，分离出输尿管，用“0”号丝线分别在输尿管接近肾盂处及远离肾盂约1.0cm处结扎输尿管，在两结扎处之间离断输尿管，用头孢甲肟生理盐水反复冲洗腹腔后，检查无尿液渗漏、出血后，先缝合肌肉及筋膜层，再缝合背部皮肤，碘伏消毒3遍，覆盖无菌纱布。假手术组24只大鼠省略结扎输尿管及离断输尿管，余处理同前。假手术组及UUO模型组每日给予2mL生理盐水灌胃，吡非尼酮组给予吡非尼酮(250mg/kg·d溶于2mL生理盐水灌胃)，各组大鼠在分别于术后第3、7、14天处死8只。处死前采足量静脉血备用，取出左肾组织备用。将各组肾脏组织脱水、透明、浸蜡及包埋，蜡块切片，行HE染色、Masson染色和免疫组化检测。
1.2.2生化指标检测
各组大鼠静脉血行血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)生化检测，尿液行24h尿蛋白定量检测。
1.2.3HE染色
各组肾组织依次脱水、透明、浸蜡及包埋，制成3m切片，分别行HE染色，观察肾小管间质损伤和纤维化状况。HE染色后，将玻片置于光镜下观察，选取10个400倍不同视野，参考文献[7]方法评估肾小管间质损伤程度，用TLS评分表示。
1.2.4Masson染色
各组肾组织依次进行脱水、透明、浸蜡及包埋，制成3m切片，分别行Masson染色，观察肾间质纤维化程度。Masson染色后，将玻片置于光镜下观察，选取10个200倍不同视野，参考文献[8]方法评估肾小管间质损伤程度，用RIF指数评分表示。
1.2.5免疫组化步骤
将3m厚的石蜡切片装入免疫组化染色提篮中，60℃烤箱烤片15min。切片给予正常脱蜡至水。浸入枸橼酸盐缓冲液，微波炉在MEDLO条件下热修复10min，2次。滴加适当稀释的一抗，4℃冰箱过夜。次日取出湿盒恢复室温。滴加生物素化兔IgG，37℃孵育20min。滴加SABC，37℃孵育30min。DAB显色，室温显色，镜下控制反应时间，显色后蒸馏水洗涤，封片。光镜下观察GSK-3β蛋白、β-catenin蛋白表达状况，视野内表现为棕黄色的颗粒为染色阳性指标。在200倍光镜下随机观察10个不同视野，利用图像分析系统分析两组肾组织阳性染色(棕黄色颗粒)的平均光密度，用AOD表示。
1.3统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，所测数据均以均数±标准差(±s)的形式表示，三组各均数比较采用单因素方差分析，P<0.05时存在统计学意义。
2结果
2.1生化分析
假手术组各时间点大鼠血BUN、Scr等生化指标无明显差异(P>0.05)。与假手术组比较，UUO模型组大鼠血BUN、Scr等生化指标明显升高，切随着时间的延长，呈正相关，吡非尼酮组大鼠血BUN、Scr等生化指标较UUO模型组各指标有所降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。
2.2Masson染色
光镜下可见假手术组大鼠在3、7、14d时肾小球及肾小管未见明显改变。UUO模型组大鼠随着梗阻时间的延长，肾小管扩张、变形，肾小管上皮细胞变性、坏死，肾小管间质可见炎性细胞浸润，基底膜细胞破坏的程度逐渐加重。吡非尼酮组肾小管间质可见炎性细胞浸润现象，但基底膜细胞及肾小管上皮细胞破坏程度及炎性物质浸润程度均较UUO组减轻，三组在对应时间点，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。
2.3免疫组化
2.3.1三组实验大鼠GSK-3β蛋白的表达
假手术组各大鼠肾小管上皮细胞可见GSK3-β蛋白少量表达；与假手术组相比，UUO组大鼠肾间质GSK3-β蛋白表达增加，且随梗阻时间的延长表达量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与UUO组相比，吡非尼酮组各大鼠GSK3-β蛋白表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。
2.3.2三组实验大鼠β-cateni蛋白在肾小管表达状况
假手术组肾小管内，β-cateni蛋白少量表达；UUO组各大鼠β-cateni蛋白表达增加明显，且随梗阻时间的延长表达量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与UUO组相比，吡非尼酮组相应时间β-catenin蛋白表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
3讨论
GSK3-β蛋白现主要研究其在参与肿瘤细胞的凋亡、调节能量代谢过程研究较多，其在肾间质纤维化中的作用国内外少有人研究。赵凯等研究发现GSK3-β蛋白在纤维化组织中存在高表达，应用特异性GSK3-β抑制剂可降低GSK3-β的表达进而减轻肾纤维化，上述研究表明GSK3-β在肾纤维化中具有重要作用。GSK3-β有望成为在肾间质纤维化研究中的新作用靶点[9]。Wnt基因是在发现的wingless基因与int-1基因的基础上所命名[10]。
Wnt信号通路作为生物机体的一个重要信号通路，生理状态下，它按程序规律地激活和静止，是诱导生物正常组织分化的信号，参与胚胎进化及组织发育过程中的细胞增殖、极化与凋亡。目前研究证实在肾组织发育中，Wnt/β-catenin信号通路是必需的分子信息传递系统，其表达异常与RIF存在相关联系，且目前尚无特效的治疗方法[11]。黄伟等人[12]运用梗阻性肾纤维化模型，发现Wnt信号通路及靶基因蛋白β-catenin、MMP-7随着梗阻时间延长逐渐升高。陈华等人研究发现，在UUO大鼠模型中β-catenin及其下游因子MMP-7、FN等都有不同程度升高，且与梗阻时间呈正相关。[13]当机体受到体内外刺激时导致Wnt信号活化，进而影响GSK3-β等的表达，引起β-catenin降解减少，未降解的β-catenin可进入细胞核，调控Wnt信号通路的下游靶基因MMP-7、FN等的表达，进而影响细胞增殖、分化、迁移、凋亡等功能。[14]β-catenin入核后与核内转录因子T细胞因子TCF结合形成β-catenin/TCF转录复合体，实现对Wnt信号通路中下游基因的转录调控，进而发挥其生物学效应[15]。β-catenin与E-钙粘蛋白（E-cadherin）等结合，致肾小管间充质细胞-上皮细胞转分化(mesenchymal-epithelialtransition，MET）的发生[16]。GSK3-β及β-catenin在肾纤维化的发生与进展中起到了重要的作用。
结合本实验的结果，证实了GSK3-β、WNT/β-catenin信号通路在肾间质纤维中有着重要的作用。在肾损伤及纤维化中，肾小管上皮-间质（EMT）转分化，原有肾小管上皮细胞丢失其原有特性，逐渐诱导转变为间质细胞，导致肾小管原有功能消失，进而导致肾功能下降及消失。GSK3-β作为WNT/β-catenin信号通路中重要的作用因子，自身存在影响纤维化及β-catenin蛋白降解的双重作用。研究发现吡非尼酮可通过抑制GSK3-β的表达，影响WNT/β-catenin信号通路中β-catenin蛋白的降解，进而引起下游MMP-7、FN等因子的表达，从而减轻及延缓肾间质纤维化的进程。本研究旨在研究，GSK3-β蛋白对肾间质纤维的影响，及其可能新的分子通路，为临床延缓肾脏纤维化进程提供新的靶点及理论依据。
参考文献
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