摘要：文章从柴胡中提取柴胡皂苷，并优化柴胡皂苷微囊工艺参数，以提高微囊的包封率和稳定性。采用乙醇加热回流法提取柴胡皂苷，以包封率为评价指标，进行单因素及正交实验优化工艺参数，并用单凝聚法制备柴胡皂苷微囊，最后对柴胡皂苷微囊进行相关质量评价。结果表明，柴胡皂苷用乙醇加热回流法提取的得率为2.25%，制备柴胡皂苷微囊的最佳工艺参数为：加热温度52℃、搅拌速率600 r/min、溶剂体积30 mL，制备的柴胡皂苷微囊具有良好稳定性和较高包封率。乙醇加热回流法得率高且方法简便易于操作，用单凝聚法制备的柴胡皂苷微囊具有良好的外观质量、较高的包封率和稳定性。
关键词：皂苷,微囊,单因素实验,正交实验
0引言
柴胡来源于伞形科植物柴胡或者狭叶柴胡的干燥根及根茎，是多年生草本植物[1]。其味苦而微辛，有解表退热、升举阳气、疏肝解郁之功效，常用于治疗感冒发热、呕吐腹痛、月经不调、肝郁气滞等症[2]。现代研究表明，柴胡中含有多种活性成分，其中，柴胡皂苷是柴胡中的主要活性成分。目前柴胡皂苷剂型有片剂、胶囊剂、汤剂等，但因柴胡皂苷稳定性较差，在储存和处理过程中容易发生降解，影响其药效和质量，影响药物的疗效和安全性，故考虑将其制备成微囊。柴胡皂苷微囊化后可以减少给药时间、避免血药浓度过高、减少患者不良反应发生的频率等，也可以改善其物化性质、控制药物释放，并提高其生物利用度和安全性。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1药品与试剂
药品：柴胡药材来源于甘肃省，甘肃数字本草检验中心有限公司鉴定为正品。
试剂：柴胡(成都埃法生物科技有限公司，对照品)，乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，AR)，甲醇(天津市大茂化学试剂厂，AR)，二甲氨基苯甲醛(天津市大茂化学试剂厂，AR)，浓硫酸(开封市泰合化工有限公司，AR)，乙酸乙酯(福晨化学试剂有限公司AR)。
1.1.2主要仪器
循环水式真空泵(河北博汇仪器有限公司，型号：SHB-III)，紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司，型号：SP-756P)，正置生物显微镜(重庆澳浦光电技术有限公司，型号：UB203i)，恒温加热磁力搅拌器(上海力辰邦西仪器科技有限公司，型号：DF101S)，高速台式冷冻离心机(长沙高新技术产业开发区项仪离心机仪器有限公司，型号：H-1650R)。
1.2方法
1.2.1柴胡的前处理
首先应选择品质良好的柴胡，将其放置水中浸泡并去除杂质，清洗后将柴胡放置干燥箱中干燥，后放入多功能粉碎机中粉碎，最后过40目筛得柴胡粉末。
1.2.2柴胡皂苷的提取
精密称取上述柴胡粉末，置于圆底烧瓶，加入浓度95%的乙醇溶液，料液比1:20 g/mL，加热回流，提取3 h，趁热过滤，收集滤液，减压回收乙醇，得到浸膏，经干燥箱干燥后，得柴胡皂苷粉末[3]。
1.2.3柴胡提取物的定性
冰醋酸-浓硫酸反应鉴别：精密称取柴胡皂苷粉末1.0 g，加入10 mL冰醋酸溶液，静置12 h后过滤，将滤液置试管中，加入0.5 mL的浓硫酸，观察现象。
1.2.4供试品、对照品溶液的配制及最大吸收波长的选择
(1)供试品溶液的配制
精密称定柴胡皂苷粉末20 mg，置50 mL容量瓶中，加入甲醇使其超声溶解，然后稀释定容到20 mL容量瓶中并摇匀[4]。
(2)对照品溶液的配制
精密称定柴胡皂苷对照品，用甲醇配成浓度2.0 mg/mL的对照品溶液。
(3)最大吸收波长的选择
精密吸取100μL柴胡皂苷对照品溶液置试管中，加50μL对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液(0.1%)，60℃条件下水浴20 min，自然冷却后，加入2.0 mL磷酸，继续反应40 min[5]。在200～800 nm波长范围内进行扫描，确定最大吸收波长。
1.2.5标准曲线的绘制
取柴胡皂苷对照品溶液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL置10 mL容量瓶，用甲醇稀释定容至刻度线。分别精密吸取1.0 mL，置10 mL容量瓶中，分别加入0.1%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液1 mL，摇匀在80℃条件下反应10 min，取出放冷后加入磷酸5.0 mL，摇匀在80℃下反应30 min，取出放冷在最大吸收波长条件下分别测定吸光度[6]。以柴胡皂苷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.6柴胡皂苷的得率
将柴胡皂苷供试品溶液用95%乙醇定容到50 mL容量瓶中，并取1 mL置于25 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度线，在最大吸收波长条件下测定三组吸光度，求其平均值，代入标准曲线计算得浓度C，皂苷的得率按式(1)计算：
得率(%)=C×V×D/M×100%(1)
式中：C为回归方程计算得到的柴胡皂苷浓度(mg/mL)；V为柴胡皂苷提取液定容后的体积(mL)；D为1 mL提取液定容后的体积(mL)；M为柴胡皂苷粉末的质量(mg)。
1.2.7柴胡皂苷微囊处方的确定
用凝聚法制备柴胡皂苷微囊，确定处方为柴胡皂苷0.2 g、明胶0.2 g、液体石蜡6 mL、司盘-80 6 mL、异丙醇4 mL、甲醛4 mL、蒸馏水及正己烷适量[7]。
1.2.8制备柴胡皂苷微囊的工艺流程
称取明胶0.2 g，用6 mL蒸馏水浸泡40 min溶解，按1∶1比例加入柴胡皂苷，充分搅拌备用。取液体石蜡6 mL，加司盘-80 6 mL均匀混合并溶解。在温度50℃、搅拌速率600 r/min条件下，把含药明胶溶液以线状加入到液体石蜡和司盘-80的混合溶液中，边加边搅拌，10 min后迅速冷却至室温，静置30 min，加异丙醇4 mL脱水，加甲醛4 mL固化后，冰箱放置24 h，抽滤，用少量无水乙醇洗涤，再用正己烷洗涤，晾干后得到微囊[8]。
1.2.9微囊单因素实验
(1)加热温度：固定搅拌速率和溶剂体积，改变加热温度(40、50、60℃)。
(2)搅拌速率：固定加热温度和溶剂体积，改变搅拌速率(500、600、700 r/min)。
(3)溶剂体积：固定加热温度和搅拌速率，改变溶剂体积(16、22、28 mL)。
1.2.10微囊正交实验
在单因素实验基础上，以包封率为评价指标，加热温度、搅拌速率及溶剂体积为考察因素，设计正交实验，得出制备柴胡皂苷微囊的最佳工艺条件参数[9]。
1.2.11质量评价的测定
根据参考文献对柴胡皂苷微囊进行外观形态、稳定性及包封率的质量评定[10]。
(1)外观形态：取适量微囊于载玻片上，在正置生物显微镜下观察其外观形态。
(2)稳定性：将柴胡皂苷微囊分别在40、50、60℃存放，进行稳定性测试。
(3)包封率：精密称取柴胡皂苷微囊适量，加入10 mL无水乙醇，再精密吸取2 mL于25 mL烧杯中，加入稀盐酸至刻度，在最大波长处测定其吸收度，计算柴胡皂苷微囊中药物的实际含量。
2实验结果
2.1柴胡皂苷定性
根据1.2.3节观察到柴胡皂苷在液面交接处呈现棕色或者红棕色环[11]。
2.2最大吸收波长的确定
根据1.2.4节(3)最大吸收波长选择，在对照品溶液中加入对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液和磷酸后，确定最大吸收波长为536 nm。
2.3标准曲线绘制
通过1.2.5节实验，绘制柴胡皂苷标准曲线图，如图1所示。
计算得到回归方程为y=18.931x+0.070 7，R2=0.995 0。结果显示对照品溶在0.001～0.020 mg/mL范围内，吸光度与浓度具有良好的线性关系。
2.4柴胡皂苷得率
根据1.2.6节方法，柴胡皂苷提取液在536 nm处测得三组吸光度，并求其平均值，根据标准曲线计算柴胡皂苷浓度，计算得柴胡皂苷得率为2.25%。
2.5柴胡皂苷微囊单因素实验结果
2.5.1加热温度对柴胡皂苷微囊包封率的影响
在搅拌速率为500 r/min、溶剂体积为16 mL、加热温度分别为40、50、60℃条件下进行实验[12]，结果如图2所示。
由图2可知温度为50℃时包封率最高为57.01%，故加热温度选择50℃。
2.5.2搅拌速率对柴胡皂苷微囊包封率的影响
在加热温度50℃、溶剂体积22 mL、搅拌速率分别为500、600、700 r/min条件下进行实验，结果如图3所示。
由图3可知，搅拌速率600 r/min时包封率为60.97%，故搅拌速率选择600 r/min。
2.5.3溶剂体积对柴胡皂苷微囊包封率的影响
在加热温度50℃、搅拌速率600 r/min、溶剂体积分别为16、22、28 mL条件下进行实验，结果如图4所示。
由图4可知，溶剂体积为28 mL时包封率达62.12%，故溶剂体积选择28 mL。
2.6柴胡皂苷微囊的正交实验结果
正交因素水平表如表1所示，实验结果如表2所示。
由正交实验的结果，通过比较极差R的大小分析可知，影响微囊制备的三个因素的大小顺序为C、B、A，通过每个因素的三个水平比较K值的大小，由此可知加热温度(A)由大到小顺序为3、2、1，搅拌速率(B)由大到小顺序为2、3、1，溶剂体积(C)由大到小顺序为3、2、1。由此可知最佳组合为A3B2C3，即最佳制备工艺参数为：加热温度52℃,搅拌速率600 r/min，溶剂体积30 mL[13]。
2.7质量评价
2.7.1柴胡皂苷微囊的外观形态
根据1.2.11节(1)观察到制备出的微囊大小较均匀、数量多、无黏连等现象[14]。
2.7.2柴胡皂苷微囊的稳定性
根据1.2.11节(2)观察到柴胡皂苷微囊在50℃条件下，未表现出明显的分层、浑浊等现象，说明在50℃条件下稳定性良好。
2.7.3柴胡皂苷的包封率
根据1.2.11节(3)中包封率的计算方法，用最佳工艺参数再次制备三组柴胡皂苷微囊，其包封率分别为60.05%、61.15%、60.24%，符合标准。
3结论与讨论
本实验首先通过乙醇加热回流法从柴胡药材中提取柴胡皂苷，得率为2.25%，然后采用单凝聚法制备柴胡皂苷微囊，并用单因素及正交实验得最佳制备工艺参数为加热温度52℃、搅拌速率600 r/min、溶剂体积30 mL，最后对柴胡皂苷微囊进行相关质量评价，成功制备出高包封率和良好稳定性的柴胡皂苷微囊。
综上所述，柴胡皂苷提取方法简单易行，优化的制备工艺参数能制得高包封率和稳定性强的柴胡皂苷微囊，此实验能为进一步开发和利用柴胡提供科学依据。
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